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Bioengineering

Au@Carbon 도트 나노프로브를 기반으로 하는 Label-Free Surface-Enhanced Raman Scattering Bioanalysis

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65524
, , , , , , ,
1MOE Key Laboratory of Laser Life Science & Guangdong Provincial Key Laboratory of Life Science, College of Biophotonics,South China Normal University

Summary

본 연구에서는 생체적합성이 우수한 저비용 표면 강화 라만 산란(SERS) 기반 지문 나노프로브를 개발하여 비파괴 방법으로 살아있는 세포의 SERS 스펙트럼을 얻는 방법을 자세히 보여주기 위해 라벨이 없는 생세포 바이오이미징을 보여주고 두 가지 박테리아 균주를 검출했습니다.

Abstract

표면 강화 라만 산란(SERS) 기술은 생물학적 샘플의 분자 지문 정보를 제공할 수 있는 능력과 단일 세포 분석의 잠재력으로 인해 생물 의학 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 이 연구는 Au@carbon 도트 나노프로브(Au@CDs)를 기반으로 하는 무표지 SERS 바이오분석을 위한 간단한 전략을 수립하는 것을 목표로 합니다. 여기서, 폴리페놀 유래 CD는 코어쉘 Au@CD 나노구조를 빠르게 합성하기 위한 환원제로 활용되며, 이는 협력적인 라만 강화 메커니즘으로 인해 메틸렌 블루(MB)의 농도가 10-9M 로 낮을 때에도 강력한 SERS 성능을 가능하게 합니다. 생물 분석의 경우 Au@CDs 고유한 SERS 나노센서 역할을 하여 생물 시료의 세포 구성 요소(예: 암세포 및 박테리아)를 식별할 수 있습니다. 다른 종의 분자 지문은 주성분 분석과 조합한 후에 더 구별될 수 있습니다. 또한 Au@CDs 무표지 SERS 이미징을 통해 세포 내 조성 프로파일을 분석할 수 있습니다. 이 전략은 실현 가능하고 라벨이 없는 SERS 생물 분석을 제공하여 나노 진단에 대한 새로운 전망을 열어줍니다.

Introduction

단일 세포 분석은 세포 이질성을 밝히고 세포의 포괄적인 상태를 평가하는 연구에 필수적입니다. 미세 환경에 대한 세포의 즉각적인 반응은 또한 단일 세포 분석을 보증합니다1. 그러나 현재 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 형광 검출은 단일 세포 분석에 적용할 수 있지만 낮은 감도로 인해 제한적입니다. 다른 문제는 세포의 복잡한 형광 배경과 장기간 조사하에서 형광 광표백으로 인해 발생합니다2. 표면 강화 라만 산란(SERS)은 (1) 고유 분자 지문 정보 및 순간 상황 반영, (2) 초고표면 감도, (3) 편리한 다중 검출, (4) 높은 광안정성, (5) 비교 분석을 위한 검출 정량화, (6) NIR 파장 여기를 통한 세포 자가형광 방지, (7) 세포 수용액에서 검출 수행 가능 등의 장점으로 인해 단일 세포 분석 측면에서 적합할 수 있습니다 환경 및 (8) 검출은 셀 내의 특정 영역(3,4,5)으로 지시될 수 있다.

SERS를 근본적인 현상으로 이해하는 데는 널리 알려진 두 가지 메커니즘이 있습니다 : 지배적 인 이유로서의 전자기 강화 (EM)와 화학적 향상 (CM). EM은 여기장의 주어진 주파수에서 입사광의 주파수가 금속에서 진동하는 자유 전자의 주파수와 일치할 때 전자기파에 의해 구동되는 집단 전자의 진동을 말하며, 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 발생시킵니다. 국소 SPR(LSPR)이 금속 나노입자(NP)에 충돌하는 입사 레이저를 통해 발생하면 입사광의 공진 흡수 또는 산란을 유발합니다. 결과적으로, 금속 NP의 표면 전자기장 강도는 2-5 차수로 향상 될 수있다4. 그러나 SERS의 엄청난 향상의 핵심은 단일 금속 NP가 아니라 두 NP 사이의 간격이 핫 스폿을 만드는 것입니다. CM은 (1) 표적 분자와 금속 NP 사이의 상호 작용 및 (2) 표적 분자가 금속 NP로 /로부터 전자를 전달할 수 있는 것을 포함하여 양면에서 생성됩니다(4,5). 보다 자세한 내용은 이 리뷰 기사 4,5에서 찾을 수 있습니다. 살아있는 세포에서 SERS 생체 감지 및 이미징을 위한 몇 가지 유망한 방법이 이전 문헌에서 제시되었는데, 예를 들어, 아폽토시스 세포(apoptotic cells)6, 세포 소기관(organelles)7의 단백질(protein in organelles)7, 세포내 miRNAs8, 세포 지질막(cellular lipid membranes)9사이토카인(cytokines)10 및 대사산물(metaboleight)11의 검출, 공초점 SERS 이미징(confocal SERS imaging)2에 의한 세포의 식별 및 모니터링, 11,12,13. 흥미롭게도, 무표지 SERS는 내부 분자 스펙트럼을 설명할 수 있는 SERS의 독특한 장점을 제시한다5.

무표지 SERS의 주요 쟁점은 합리적이고 신뢰할 수 있는 기판입니다. 전형적인 SERS 기판은 많은 빛을 산란시키는 우수한 능력 때문에 귀금속 NP이다14. 오늘날 나노 복합체는 놀라운 물리적, 화학적 특성과 생체 적합성으로 인해 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 더 중요한 것은, 나노복합체는 나노하이브리드의 핫스팟에 의해 유도된 강렬한 EM과 다른 비금속 물질로부터 유래하는 추가적인 화학적 향상으로 인해 더 나은 SERS 활성을 나타낼 수 있다는것이다 15. 예를 들어, Fei et al. 마우스 4T1 유방암 세포(4T1 세포)의 무표지 근적외선(NIR) SERS 이미징을 위한 Au NP@MoS 2 QD 나노복합체를 합성하기 위해 MoS2양자점(QD)을 환원제로 사용했습니다16. 또한, Li 등은 식인성 병원성 박테리아의 무표지 SERS 측정을 위해 Au NPs 및 2D 하프늄 디텔루라이드 나노시트로 구성된 2D SERS 기판을 제작했다17. 최근, 좋은 전자 공여체인 탄소 도트(CD)는 다른 환원제나 조사 없이 환원제로 사용되어 Au@carbon 도트 나노프로브(Au@CDs)18를 합성하고 있으며, 이는 Au 코어와 CD 쉘 사이의 전하 이동(CT) 효과에 기초하여 SERS 활성을 향상시키는 효율적인 물질로 보고되고 있다(19,20). 그 이상으로, CD는 Au NP가 응집되는 것을 방지하기 위한 캡핑제 및 안정제로 인식된다21. 또한, 분석물과의 반응에 대한 더 많은 가능성을 열어주는데, 이는 많은 수의 결합 및 활성 부위(20)를 제공할 수 있기 때문이다. 위의 내용을 활용하여 Jin et al. 실시간으로 불균일한 촉매 반응을 모니터링하기 위해 고유한 SERS 특성과 우수한 촉매 활성을 가진 Ag@CD NP를 제조하기 위한 빠르고 제어 가능한 방법을 개발했습니다(18).

여기에서 세포 구성 요소 및 라벨이 없는 SERS 생세포 바이오이미징을 식별하고 대장 균(E. coli) 및 황색포도상구균 (S. aureus)을 검출 및 분화하기 위해 코어쉘 Au@CD SERS 기질을 제조하는 용이하고 저렴한 방법이 입증되었으며, 이는 질병의 조기 진단과 세포 과정에 대한 더 나은 이해를 약속합니다.

Protocol

1. Au@CDs의 제작 참고: 그림 1 은 Au@CDs에 대한 제조 절차를 보여줍니다. 전형적인 열수 처리 절차18을 통해 시트르산(CA)과 갈산(GA)을 사용하여 CD 용액을 준비합니다. 준비된 CD 용액 100μL의 3.0mg mL-1을 10mM 염화금산(HAuCl4) 200μL에 실온에서 보라색 현탁액이 생성될 때까지 10초 동안 추가합니다.<stron…

Representative Results

Au@CDs의 제작은 그림 1에 나와 있습니다. CD는 전형적인 열수 공정18을 통해 CA 및 GA로부터 제조되었다. Au@CDs 실온에서 수성 매질에서 CD에 의해 HAuCl4를 환원시킴으로써 신속하게 합성되었다. CD 및 Au@CDs의 크기 및 형태는 TEM 및 고분해능(HR)TEM23에 의해 관찰될 수 있다. 준비된 CD는 거의 2-6nm의 작은 크기로 단분산됩…

Discussion

요약하면, 2.1nm의 초박형 CD 쉘을 가진 Au@CDs이 성공적으로 제작되었습니다. 나노 복합체는 순수한 Au NP보다 우수한 SERS 감도를 보여줍니다. 또한 Au@CDs 재현성과 장기 안정성에서 우수한 성능을 가지고 있습니다. 추가 연구에는 A549 세포(31)의 SERS 이미징을 수행하고 2개의 박테리아 균주(32)를 검출하기 위해 Au@CDs 기질로 사용하는 것이 포함됩니다. Au@CDs는 주로 Au NP…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(32071399 및 62175071), 광저우 과학 기술 프로그램(2019050001), 광동 기초 및 응용 기초 연구 재단(2021A1515011988) 및 중국 교육부 광전자 과학 기술 핵심 연구소(푸젠 사범 대학) 개방형 재단(JYG2009)의 지원을 받았습니다.

Materials

10x PBS buffer (Cell culture) Langeco Technology BL316A
6 well cell culture plate LABSELECT 11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) GLPBIO GK10001
Citric acid Shanghai Aladdin Biochemical Technology C108869
CO2 incubator Thermo Fisher Technologies 3111
Constant temperature magnetic agitator Sartorius Scientific Instruments SQP
Cryogenic high speed centrifuge Shanghai Boxun SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium Procell PM150210
Electronic balance Sartorius Scientific Instruments SQP
Enzyme marker Thermo Fisher Technologies 3111
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biological Technology 11011-8611
Figure 1 Figdraw.
Fourier infrared spectrometer Thermo, America Nicolet 380
Freeze dryer Tecan Infinite F50
Gallic acid Shanghai Aladdin Biochemical Technology G104228
Handheld Raman spectrometer OCEANHOOD, Shanghai, China Uspectral-PLUS
HAuCl4 Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope Thermo Fisher Technologies FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave Shanghai Boxun YXQ-LS-50S Equation 2
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Yongxin Optical XD-202
LB Broth BR Huankai picoorganism 028320
Medical ultra-low temperature refrigerator Thermo Fisher Technologies ULTS1368
Methylene blue Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution beyotime C0207
Penicillin streptomycin double resistance Shanghai Boxun YXQ-LS-50S Equation 2
Pure water meter Millipore, USA Milli-Q System
Raman spectrometer Renishaw
Sapphire chip beyotime
Thermostatic water bath Changzhou Noki
Ultra-clean table Shanghai Boxun SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer MADAPA, China UV-6100S
Wire 3.4 Renishaw
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References

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Keywords: Surface-enhanced Raman ScatteringSERSBioanalysisAu Carbon Dot NanoprobesLabel-freeLive Cell Bio-imagingBacterial Strain DetectionPrincipal Component AnalysisSingle Cell AnalysisMolecular FingerprintBiocompatibilityRaman Enhancement
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Zheng, Y., Xiao, X., Li, Z., Shao, Y., Chen, J., Guo, Z., Zhong, H., Liu, Z. Label-Free Surface-Enhanced Raman Scattering Bioanalysis Based on Au@Carbon Dot Nanoprobes. J. Vis. Exp. (196), e65524, doi:10.3791/65524 (2023).
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