도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식
Summary
이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.
Abstract
정상 및 비정상적인 생체 내 세포 거동을 이해하는 것은 질병 시작 및 진행을 막기 위한 임상 개입을 개발하는 데 필요합니다. 따라서 조직 구조와 구성이 교란되지 않는 세포의 역학을 현장에서 쉽게 관찰할 수 있는 이미징 접근 방식을 최적화하는 것이 중요합니다. 표피는 신체의 가장 바깥쪽 장벽일 뿐만 아니라 가장 흔한 인간 암, 즉 피부 피부암의 근원입니다. 피부 조직의 접근성은 비침습적 생체 내 현미경을 사용하여 온전한 동물의 상피 및 피부 세포 거동을 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 이 정교한 이미징 접근 방식은 주로 정립 다광자 현미경을 사용하여 달성되었으며, 이는 대부분의 조사관에게 상당한 진입 장벽이 됩니다. 이 연구는 도립 컨포칼 현미경과 함께 사용하기에 적합한 맞춤형 3D 프린팅 현미경 스테이지 인서트를 제시하여 살아있는 형질전환 마우스에서 귀 피부의 장기 생체 내 이미징을 간소화합니다. 우리는 도립 현미경 브랜드와 선택한 모델에 맞게 맞춤화할 수 있고 추가 장기 시스템을 이미지화하는 데 적용할 수 있는 이 다재다능한 발명품이 생체 내 현미경의 접근성을 크게 향상시킴으로써 더 큰 과학 연구 커뮤니티에 매우 귀중한 것으로 입증될 것이라고 믿습니다. 이러한 기술 발전은 정상 및 질병 상황에서 살아있는 세포 역학에 대한 이해를 강화하는 데 매우 중요합니다.
Introduction
생체 내 현미경 검사는 생체 내 환경에서 교란되지 않은 세포 행동을 모니터링할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 독특한 방법은 폐1, 뇌2, 간3, 유선4, 장5, 피부6을 포함한 복잡한 포유류 장기 시스템의 내부 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다. 또한, 이 접근법은 종양 발생 중 세포 행동 변화7, 상처 치유 8,9, 염증10 및 기타 다양한 상피내 병리를 밝혀냈다. 이 연구에서는 온전한 쥐 피부에서 살아있는 상피 및 기질 역학을 이미지화하기 위해 생체 내 현미경의 접근성을 높이는 데 중점을 둡니다. 포유류 피부의 세포 거동을 이해하는 것은 이 조직의 놀라운 재생 및 종양 생성 능력으로 인해 임상적으로 매우 중요합니다.
생쥐의 생체 내 이미징은 조직 깊이>100 μm11,12에서 고해상도 이미징을 제공할 수 있는 능력으로 인해 정립 다광자 현미경을 사용하여 주로 수행되었습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 기기는 사용자 친화적이고 비용 효율적이며, 배양된 세포를 이미지화할 수 있는 기능을 제공하고, 이미지 획득 중에 완전한 어둠이 필요하지 않으며, 일반적으로 더 안전할 뿐만 아니라 다른 주목할만한 장점13,14. 이 연구에서는 도립 컨포칼 현미경에 이 접근 방식을 적용하여 생체 내 이미징 접근성을 크게 향상시키는 새로운 도구를 제시합니다.
여기에서는 도립 컨포칼 현미경에서 쥐 귀 피부의 안정적이고 장기적인 생체 내 이미징을 용이하게 하기 위해 몇 가지 주요 기능을 통합한 3D 프린팅 맞춤형 스테이지 인서트 디자인을 소개합니다(그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4 및 그림 5). 이러한 특수 기능에는 이미징 중에 성인 마우스의 전체 몸체를 완전히 평평하게 놓을 수 있는 오프셋 대물렌즈 구멍이 포함됩니다. 이는 이미징에서 마우스 몸 움직임의 진동 간섭을 최소화하고 호흡을 완화하기 위해 케타민과 자일라진을 투여할 필요가 없으며, 이는 종종 생체 내 이미징과 결합되는 관행입니다6. 또한 인서트의 코너 브래킷은 이소플루란 노즈 콘을 마우스 페이스에 맞게 올바르게 배치하고, 금속 이어 클립은 마우스 귀를 맞춤형 커버슬립 디스크에 고정하며, 옵션인 탈착식 폐쇄 루프 바이오피드백 히트 플레이트는 긴 이미징 세션 동안 마우스 체온을 지원하기 위해 인서트 내에 평평하게 놓여 있습니다. 마우스 머리와 귀를 평평하게 놓는 데 필수적인 평평한 표면을 제공하는 맞춤형 커버슬립 디스크는 기계 공장에서 일반 커버슬립 함유 세포 배양 접시의 벽을 제거하여 생성되었습니다. 커버슬립 디스크 및 맞춤형 스테이지 인서트와 함께 40x 실리콘 오일 이멀젼 렌즈(1.25 개구수[N.A.], 0.3mm 작동 거리)를 사용하여 귀 진피 깊이>50μm)의 고해상도 이미지를 제공합니다.
이 새로운 도립 현미경 스테이지 인서트의 기능을 테스트하기 위해 살아있는 형질전환 K14-H2B-mCherry15 성체 마우스의 귀에서 3시간 동안 모든 표피 상피층에 걸쳐 있는 z-스택을 캡처했습니다(이 마우스 라인의 상피 핵에는 빨간색 형광 라벨이 포함되어 있음)(그림 6A-A‘). 우리는 또한 살아있는 형질전환 Pdgfra-rtTA16의 귀에서 3시간 동안 피부 진피 내의 여러 섬유아세포층에 걸쳐 있는 z-스택을 캡처했습니다. pTRE-H2B-GFP17 성체 마우스(이 마우스 라인의 섬유아세포 핵에는 독시사이클린 유도 후 녹색 형광 라벨이 포함되어 있음)(그림 6B-D‘). 당사의 고해상도 데이터는 x-, y-, z-평면의 드리프트 부족으로 일관된 안정성을 보여주며, 이를 통해 도립 현미경에 사용할 수 있는 이 새로운 생체 내 이미징 도구의 효과를 입증합니다. 중요한 것은 이 3D 프린팅 스테이지 인서트의 치수는 보충 파일 1, 보충 파일 2 및 보충 파일 3에 설명된 대로 도립 현미경에 맞게 조정할 수 있으며, 대물렌즈 개구부의 위치를 인서트 내의 다른 위치로 이동하여 특정 조직 및/또는 관심 동물 모델의 이미징에 더 적합하게 만들 수 있다는 것입니다. 따라서 이 발명은 개별 실험실 또는 핵심 시설 공초점 접근 권한이 있는 연구자가 고유한 생체 내 이미징 요구 사항에 맞게 이 도구를 조정할 수 있도록 하여 다양한 생체 내 세포 생물학의 평가를 간소화할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 도립 컨포칼 현미경에서 온전한 쥐 피부 상피의 안정적이고 장기적인 생체 내 이미징을 촉진하는 새로운 도구를 제시합니다. 이 발명품은 가장 일반적이고 저렴한 3D 프린팅 가능한 재료인 PLA로 만들어졌습니다. 이 인서트에 대한 모든 사내 3D 프린팅 비용은 <$5입니다. 두 개의 개별 삽입 조각(그림 1, 보충 파일 1 및 보충 파일 2)은 고정 나사를 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K14-mCherry-H2B 마우스에 대해 Valentina Greco에게 감사드립니다. 유리 커버슬립 디스크를 생성해 주신 Emory University Physics Department Machine Shop에 감사드립니다. 이 연구는 미국 재향군인회 BLRD Service의 경력 개발상 #IK2 BX005370 LS에, NIH Awards RF1-AG079269 및 R56-AG072473 MJMR에, I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award에 MJMR의 지원을 받았습니다.
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
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