Strömlinjeformad intravital avbildningsmetod för långtidsövervakning av epitelvävnadsdynamik på ett inverterat konfokalmikroskop

Summary

Protokollet presenterar ett nytt verktyg för att förenkla intravital avbildning med hjälp av inverterad konfokalmikroskopi.

Abstract

Att förstå normala och avvikande in vivo-cellbeteenden är nödvändigt för att utveckla kliniska interventioner för att motverka sjukdomsinitiering och progression. Det är därför viktigt att optimera avbildningsmetoder som underlättar observationen av celldynamik in situ, där vävnadsstruktur och sammansättning förblir ostörda. Epidermis är kroppens yttersta barriär, liksom källan till de vanligaste cancerformerna hos människor, nämligen hudcancer. Tillgängligheten av hudvävnad ger en unik möjlighet att övervaka epitel- och dermala cellbeteenden hos intakta djur med hjälp av icke-invasiv intravital mikroskopi. Ändå har denna sofistikerade avbildningsmetod främst uppnåtts med hjälp av upprättstående multifotonmikroskop, som utgör ett betydande inträdeshinder för de flesta utredare. Denna studie presenterar en specialdesignad, 3D-printad mikroskopsteginsats som är lämplig för användning med inverterade konfokalmikroskop, vilket effektiviserar den långsiktiga intravitala avbildningen av öronhud i levande transgena möss. Vi tror att denna mångsidiga uppfinning, som kan skräddarsys för att passa det inverterade mikroskopets varumärke och modell och anpassas för att avbilda ytterligare organsystem, kommer att visa sig vara ovärderlig för det större vetenskapliga forskarsamhället genom att avsevärt förbättra tillgängligheten av intravital mikroskopi. Dessa tekniska framsteg är avgörande för att stärka vår förståelse av levande cellers dynamik i normala och sjukdomssammanhang.

Introduction

Intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt att övervaka cellernas beteende i deras ostörda in vivo-miljöer. Denna unika metod har gett viktiga insikter i hur komplexa däggdjursorgansystem fungerar, inklusive lunga¹, hjärna², lever³, bröstkörtel⁴, tarm⁵ och hud⁶. Dessutom har detta tillvägagångssätt avslöjat cellbeteendeförändringar under tumörutveckling⁷, sårläkning^8,9, inflammation¹⁰ och andra olika patologier in situ. I denna studie fokuserar vi på att förbättra tillgängligheten av intravital mikroskopi för att avbilda levande epitel- och stromadynamik i intakt mushud. Att förstå cellbeteenden i däggdjurshud är av stor klinisk betydelse på grund av den anmärkningsvärda regenerativa och tumörframkallande kapaciteten hos denna vävnad.

Intravital avbildning i möss har främst utförts med upprättstående multifotonmikroskop på grund av deras förmåga att ge högupplöst avbildning på vävnadsdjup >100 μm^11,12. Ändå saknar dessa instrument arbetshästens mångsidighet och mer allmänna tillgänglighet hos inverterade konfokalmikroskop, som är mer användarvänliga och kostnadseffektiva, ger möjlighet att avbilda odlade celler, inte kräver fullständigt mörker under bildtagning och är i allmänhet säkrare, bland andra anmärkningsvärda fördelar^13,14. I denna studie presenterar vi ett nytt verktyg som avsevärt förbättrar tillgängligheten för intravital avbildning genom att anpassa detta tillvägagångssätt för inverterade konfokalmikroskop.

Här presenterar vi en 3D-printad anpassad sceninsatsdesign som innehåller flera nyckelfunktioner för att underlätta stabil, långsiktig intravital avbildning av musöronhud på ett inverterat konfokalmikroskop (Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4 och Figur 5). Dessa specialiserade funktioner inkluderar ett förskjutet objektivhål som gör att hela kroppen på en vuxen mus kan ligga helt platt under avbildning. Detta minimerar vibrationsstörningarna av musens kroppsrörelser vid avbildning och eliminerar behovet av att administrera ketamin och xylazin för att dämpa andningen, en praxis som ofta kombineras med intravital avbildning⁶. Dessutom placerar hörnfästena på insatsen en noskon med isofluran korrekt så att den är i linje med musens framsida, en öronklämma i metall immobiliserar musörat till en specialbyggd täckskiva och en valfri löstagbar biofeedback-värmeplatta med sluten slinga ligger i jämnhöjd med insatsen för att stödja musens kroppstemperatur under långa bildsessioner. Den anpassade täckskivan, som ger en plan yta som är nödvändig för att mushuvudet och örat ska kunna ligga platt, genererades i en maskinverkstad genom att ta bort väggarna på en generisk cellodlingsskål som innehåller täckglas. Användningen av en 40x silikonoljenedsänkningslins (1,25 numerisk bländare [NA], 0,3 mm arbetsavstånd) i kombination med coverslip-skivan och anpassad sceninsats ger högupplösta bilder >50 μm djupt in i örondermis.

För att testa funktionaliteten hos denna nya inverterade mikroskopstegsinsats fångade vi z-stackar som spänner över alla epidermala epitelskikt under en 3 timmars tidsförlopp i örat på en levande transgen K14-H2B-mCherry¹⁵ vuxen mus (epitelkärnor i denna muslinje innehåller en röd fluorescerande etikett) (Figur 6A-A‘). Vi fångade också z-stackar som spänner över flera fibroblastlager i huddermis under en 3 timmars tidsförlopp i örat på en levande transgen Pdgfra-rtTA¹⁶; pTRE-H2B-GFP¹⁷ vuxen mus (fibroblastkärnor i denna muslinje har en grön fluorescerande etikett efter doxycyklininduktion) (figur 6B-D‘). Våra högupplösta data visar konsekvent stabilitet genom avsaknad av drift i x-, y- och z-planen, vilket bevisar effektiviteten hos detta nya intravitala avbildningsverktyg för användning på inverterade mikroskop. Det är viktigt att notera att måtten på denna 3D-printade sceninsats kan justeras, enligt beskrivningen i Supplementary File 1, Supplementary File 2 och Supplementary File 3, för att passa alla inverterade mikroskop, och placeringen av objektivöppningen kan flyttas till alternativa platser i insatsen för att bättre passa att avbilda en viss vävnads- och/eller djurmodell av intresse. Denna uppfinning kan således göra det möjligt för enskilda laboratorier, eller forskare med konfokal åtkomst till kärnfaciliteten, att anpassa detta verktyg för sina unika intravitala avbildningsbehov, och därigenom effektivisera utvärderingen av olika in vivo-cellbiologi.

Protocol

Denna forskning utfördes i enlighet med Emory University och Atlanta Veterans Affairs Medical Center riktlinjer för djurvård och användning och har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Installation av livebildsinsatsen på det inverterade mikroskopet stage Konstruera insatsen med hjälp av .stl-filer (tilläggsfil 1, tilläggsfil 2 och tilläggsfil 3) som anger 3D-mått och design (se figur 1 och <…

Representative Results

Korrekt montering av live-bildinsatsen på ett inverterat konfokalmikroskop och lämplig orientering av en transgen mus ovanpå insatsen valideras genom att samla in z-stackar av fluorescerande märkt, levande öronvävnad under ett tidsförlopp ≥1 timme med minimala tecken på drift i x-, y- och z-axlarna. Bilder bör tas med jämna mellanrum (intervalltiden beror på den biologiska frågan, fluorescenssignalens styrka, etc.) så att celldynamik och bilddrift kan spåras över tid. Genom att övervaka enskilda z-plan …

Discussion

I denna studie presenterar vi ett nytt verktyg som underlättar stabil, långsiktig intravital avbildning av intakt mushudepitel på inverterade konfokalmikroskop. Denna uppfinning är gjord av PLA, som är det vanligaste och billigaste 3D-utskrivbara materialet; alla interna kostnader för 3D-utskrift för denna insats uppgår till < $ 5. De två separata insatsstyckena (Figur 1, Kompletterande File 1 och Supplement File 2) kan enkelt monteras med hjälp av…

Materials

3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging