גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך
Summary
הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
Abstract
הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.
Introduction
מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מיקרוסקופ תוך-חיוני לדימוי דינמיקה חיה של אפיתל וסטרומה בעור עכבר שלם. הבנת התנהגויות תאים בעור יונקים היא בעלת חשיבות קלינית גבוהה בשל יכולת ההתחדשות והגידול המדהימה של רקמה זו.
הדמיה תוך-חיונית בעכברים בוצעה בעיקר באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון זקוף בשל יכולתם לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומקי רקמות >100 מיקרומטר11,12. עם זאת, מכשירים אלה חסרים את הרבגוניות של סוס העבודה ואת הנגישות הכללית יותר של מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים, שהם ידידותיים יותר למשתמש וחסכוניים יותר, מספקים את היכולת לצלם תאים בתרבית, אינם דורשים חושך מוחלט במהלך רכישת תמונה, והם בדרך כלל בטוחים יותר, בין יתרונות בולטים אחרים13,14. במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המשפר באופן משמעותי את נגישות ההדמיה התוך-חיונית על ידי התאמת גישה זו למיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים.
כאן, אנו מציגים עיצוב של עלון במה מותאם אישית המודפס בתלת-ממד המשלב מספר תכונות עיקריות כדי להקל על הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של עור אוזני עכבר במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5). תכונות מיוחדות אלה כוללות חור אובייקטיבי אופסט המאפשר את כל הגוף של עכבר בוגר לשכב שטוח לחלוטין במהלך ההדמיה. זה ממזער את הפרעות הרטט של תנועות גוף העכבר בהדמיה ומבטל את הצורך לתת קטמין וקסילזין כדי לדכא את הנשימה, תרגול שלעתים קרובות משולב עם הדמיה תוך חיונית6. בנוסף, סוגריים פינתיים בעלון ממקמים נכון חרוט אף איזופלורני כדי ליישר קו עם פני העכבר, אטב אוזניים מתכתי משתק את אוזן העכבר לדיסק כיסוי שנבנה בהתאמה אישית, ופלטת חום ביופידבק אופציונלית בלולאה סגורה הניתנת להסרה מונחת בתוך העלון כדי לתמוך בטמפרטורת גוף העכבר במהלך מפגשי הדמיה ארוכים. דיסק הכיסוי המותאם אישית, המספק משטח שטוח החיוני לראש העכבר ולאוזן לשכב שטוחים, נוצר בחנות מכונות על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים גנרית המכילה כיסוי. השימוש בעדשת טבילה בשמן סיליקון 40x (צמצם מספרי 1.25 [N.A.], מרחק עבודה של 0.3 מ”מ) בשילוב עם דיסק הכיסוי ותוספת הבמה המותאמת אישית מספק תמונות ברזולוציה גבוהה >50 מיקרומטר עמוק לתוך הדרמיס של האוזן.
כדי לבחון את הפונקציונליות של שלב המיקרוסקופ ההפוך החדש הזה, לכדנו ערימות z המשתרעות על פני כל שכבות אפיתל האפידרמיס במהלך זמן של 3 שעות באוזן של עכבר בוגר חי מהונדס K14-H2B-mCherry15 (גרעיני אפיתל בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית אדומה) (איור 6A-A‘). לכדנו גם ערימות z המשתרעות על פני מספר שכבות פיברובלסטים בתוך דרמיס העור במהלך 3 שעות באוזן של Pdgfra-rtTA16 מהונדס חי; pTRE-H2B-GFP17 עכבר בוגר (גרעיני פיברובלסטים בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית ירוקה לאחר השראת דוקסיציקלין) (איור 6B-D‘). הנתונים ברזולוציה גבוהה שלנו מראים יציבות עקבית על ידי חוסר סחף במישורי x, y ו- z, ובכך מוכיחים את יעילותו של כלי הדמיה תוך חיוני חדש זה לשימוש במיקרוסקופים הפוכים. חשוב לציין, ניתן להתאים את הממדים של תוספת שלב זו המודפסת בתלת-ממד, כמתואר בקובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3, כך שיתאימו לכל מיקרוסקופ הפוך, וניתן להעביר את מיקום פתח המטרה למיקומים חלופיים בתוך העלון כדי להתאים טוב יותר להדמיית רקמה מסוימת ו/או מודל בעל חיים מעניין. המצאה זו יכולה אפוא להעצים מעבדות בודדות, או חוקרים עם גישה קונפוקלית למתקני הליבה, להתאים כלי זה לצרכי הדימות התוך-חיוניים הייחודיים שלהם, ובכך לייעל את ההערכה של ביולוגיה מגוונת של התא in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (<str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה”ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
- Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
- Nal Chen, ., et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy. Cells. 11 (14), 2196 (2022).
- Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).
- Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. Multidimensional imaging of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).
- Fischer, M., Edelblum, K. L. Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration. Current Protocols. 2 (8), (2022).
- Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin. Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).
- Pal Arndt, ., et al. A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system. Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).
- Oal Yam, A., et al. Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy. Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).
- Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).
- Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).
- Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
- Yoshitake, T., et al. Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue. Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).
- Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool. Nature. 522, 94-97 (2015).
- Ral Li, ., et al. Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response. eLife. 7, (2018).
- Tal Tumbar, ., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).
- Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).
