I denne protokol diskuterer vi implementeringen af en model for vellykket ortopisk levertransplantation (OLT) hos mus. Derudover diskuteres også adjuvanser til yderligere analyse af allograftpatency efter vellykket OLT i en mus, specifikt ved hjælp af mikrocomputertomografi (microCT) scanninger.
Mikrocomputertomografi (microCT) angiografi er en uvurderlig ressource for forskere. Nye fremskridt inden for denne teknologi har gjort det muligt at opnå billeder af høj kvalitet af mikrovaskulatur og er high-fidelity-værktøjer inden for organtransplantation. I denne model af ortopisk levertransplantation (OLT) hos mus giver mikroCT mulighed for at evaluere allograftanastomose i realtid og har den ekstra fordel, at man ikke behøver at ofre forsøgsdyr. Valget af kontrast samt billedoptagelsesindstillinger skaber et high-definition billede, som giver forskere uvurderlig information. Dette giver mulighed for evaluering af de tekniske aspekter af proceduren samt potentielt evaluering af forskellige behandlinger over en længere varighed. I denne protokol beskriver vi en OLT-model i mus trinvis og beskriver endelig en mikroCT-protokol, der kan give billeder af høj kvalitet, som hjælper forskere med dybdegående analyse af fast organtransplantation. Vi giver en trinvis vejledning til levertransplantation i en mus, samt kort diskutere en protokol til evaluering af transplantatets patency gennem mikroCT-angiografi.
Transplantation er den eneste effektive terapi til leversygdom i slutstadiet. Unægtelig er fordelen ved levertransplantation fremragende med en median overlevelse på 11,6 år mod 3,1 år på venteliste1. Der er imidlertid betydelige begrænsninger, som begrænser den brede anvendelse af levertransplantation og vigtigst af alt omfatter mangel på egnede donororganer af høj kvalitet. En udvidelse af donororganpuljen vil således kræve innovative strategier, der gør det muligt at anvende allotransplantater, der i øjeblikket betragtes som uegnede i dag, hvilket øger sikkerhedsmargenen for transplantation. For at forbedre adgangen til levertransplantation er det derfor bydende nødvendigt at gennemføre prækliniske undersøgelser hos små dyr.
Særligt vigtige for transplantationsforskningen er in vivo-transplantationsmodeller. Ortopisk levertransplantation med mus (OLT) har eksisteret i næsten 30 år2 og er afgørende for at studere mange aspekter af transplantation, herunder karakterisering af immunresponser, iskæmi-reperfusionsskade, akut afstødning, terapeutiske virkninger af nye midler og langsigtet overlevelse 3,4,5,6,7 . Brugen af mus til at studere transplantation er afgørende, da det giver mulighed for at bruge transgene muselinjer til at studere virkningen af specifikke molekylære veje på resultaterne af transplantation. Etablerede protokoller for muselevertransplantation er blevet godt beskrevet tidligere 8,9.
Der findes flere metoder til anastomoser for supra- og infrahepatisk ringere vena cava (IVC), portalvene (PV) og almindelig galdegang (CBD). De er typisk afhængige af enten håndanastomose eller en modificeret vaskulær manchetteknik svarende til murin lungetransplantation 10,11,12. Et vigtigt skridt i langtidsundersøgelsen og overlevelsen af modtagermusene samt udviklingen af et vedvarende muselevertransplantationsprogram er evnen til at evaluere disse kritiske anastomoser. Billeddannelsesmetoder til evaluering af leverallograftpatency er ofte afhængige af ultralyd og computertomografi (CT) i den kliniske indstilling13,14. CT har en klar fordel i forhold til ultralyd, da det kan tilbyde visninger af hele maven til at omfatte enhver anastomose, selvom det kan være særligt vanskeligt at opnå disse synspunkter med ultralyd hos små dyr. Der er afsat betydelig forskning og ressourcer til at udvikle nøjagtig mikroCT med det formål at forbedre dyreforsøg og de oplysninger, vi kan indsamle fra disse modeller for skade og sygdom 15,16. Her beskriver vi en protokol for ortopisk muselevertransplantation (figur 1) og beskriver kort en protokol for mikroCT til evaluering af allograftpatency og holdbarhed af anastomoser.
OLT hos gnavere er velbeskrevet i litteraturen 2,8. For at udføre denne teknisk krævende procedure kræves der ofte flere års mikrokirurgi (eller kirurgi generelt), da dette indebærer en robust forståelse af anatomi og teknisk evne. Under udviklingen af denne model stod vi over for flere tekniske problemer, der alle drejede sig om anastomoserne. Især med PV-anastomose er det ofte vanskeligt at stabilisere venen for anastomose. Vi har fundet ud af, at placering af en eller to suturer (kirurgpræference) hjælper med at lette manchetplaceringer. Det skal bemærkes, at placering af flere opholdssuturer øger operationstiden.
Derudover er SHIVC dybt inde i bughulen og er vanskelig at placere en klemme på for at give tilstrækkelig eksponering. Vi har fundet ud af, at hvis musen er afslappet som muligt i sin fastholdelse, vil det øge venens fleksibilitet. I sidste ende vil det være op til kirurgen at bestemme den korrekte placering med praksis. Desuden er kanalen med CBD-anastomose igen meget delikat. Det kan være svært at placere opholdssuturer for at stabilisere kanalen, og muligvis vil placering på et lille stykke gasbind hjælpe med stabilisering. Endelig, da alle små pattedyr er unikt sarte med hensyn til anæstesitid, er det vigtigt at udføre operationen så hurtigt som muligt. Ideelle kirurgiske tider er som følger: 1) donoroperation, 45-60 min; 2) forberedelse af bagbord, 15 min; 3) modtageroperation, 60-80 min. Øvelse vil hjælpe med at mindske spildt bevægelse.
Efterhånden som dyremodeller skrider frem, er evnen til at evaluere succesen med undersøgelsesinterventioner også avanceret. MicroCT blev først brugt til at gennemføre undersøgelser af vaskulatur hos rotter i slutningen af 1990’erne17. Der er mange udfordringer ved at udføre nøjagtige og klare mikroCT-angiografiundersøgelser hos gnavere. Imidlertid stammer de fleste af udfordringerne fra disse pattedyrs korte hjerte- og åndedrætscyklusser. Dette overvindes ved at bruge korte eksponeringer til at begrænse bevægelsesartefakter samt højere fotonfluenshastigheder18. Generelt fandt vi, at brugen af hjertegating samt justering af isoflurankoncentrationer for at reducere respirationsfrekvensen gav de klareste billeder. Vi har også fundet ud af, at brug af gnaverspecifik kontrasttiming til specifikke faser: leverarteriel fase, portalvenøs fase og forsinket fase også har forbedret visualisering19. Brugen af ExiTron nano 12000 kontrast har flere fordele og kan forbedre den samlede billedkvalitet. Det giver den stærkeste kontrastforbedring i leveren20 og blodet21. En anden fordel er, at kontrasten er til stede i leveren i op til 120 timer efter den første injektion, hvilket kan skære ned på associeret levertoksicitet, da mindre kontrast er nødvendig, hvis gentagne scanninger er nødvendige20.
Da scanninger udføres med musen bedøvet med isofluran, ændres kontrastforbedringen ikke med denne ændring i fysiologi20. Ved at anvende disse billeddannelsesteknikker og ExiTron-kontrast er en klar evaluering af vellykkede anastomoser i OLT mulig. MicroCT giver mulighed for ikke-invasiv evaluering af in vivo allotransplantater over en længere periode. Denne protokol reducerer antallet af dyr, der skal ofres for at evaluere vaskulære anastomoser og give mulighed for at studere terapi over flere uger og deres virkning på vaskulaturen.
Begrænsninger
Det skal bemærkes, at mens der er sket flere revisioner af OLT-modellen for at perfektionere dens teknik, er visualiseringen af anastomoserne ved hjælp af mikroCT stadig en løbende proces. Desuden giver mus OLT et unikt indblik i transplantationsmedicin. Det er dog ikke en omfattende model, da det er svært at holde disse mus i live efter 1 uge. Yderligere transplantationsmodeller bør også anvendes til yderligere at underbygge prækliniske forsøg.
Konklusioner
Fremskridt inden for mikroCT har udviklet sig hurtigt i løbet af det sidste årti, hvilket giver forskere uvurderlige nye værktøjer inden for dyremodeller og transplantation. I fremtiden vil mere detaljeret 3D-billeddannelse give yderligere indsigt i forskning og opdagelse.
The authors have nothing to disclose.
SMB støttes af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) tilskud R01DK1234750. BAW støttes gennem National Institutes of Health National Heart Lung and Blood Institute grant R01HL143000.
#11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |