ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング
Summary
本稿では,ショウ ジョウバエ・メラノガスター 第3齢幼虫から生きた外植片脳を作製,解剖,マウント,画像化し,生理条件下での細胞内・細胞内動態を観察するワークフローについて述べる.
Abstract
ショウジョウバエ 神経幹細胞(神経芽細胞、以下NB)は非対称分裂を起こし、自己複製神経芽細胞を再生すると同時に、分化神経節母細胞(GMC)を形成し、さらに1つの分裂を経て2つのニューロンまたはグリアを生成します。NBの研究により、細胞の極性、紡錘体の配向、神経幹細胞の自己複製、および分化の根底にある分子メカニズムが明らかになりました。これらの非対称細胞分裂は生細胞イメージング で 容易に観察できるため、幼虫NBは生体組織における非対称細胞分裂の時空間ダイナミクスを調べるのに理想的です。栄養補給培地で適切に解剖および画像化すると、外植片の脳のNBは12〜20時間にわたって堅牢に分裂します。前述の方法は技術的に難しく、この分野に不慣れな人にとっては難しいかもしれません。ここでは、脂肪体サプリメントを使用した生きた3齢幼虫の脳外植片の調製、解剖、マウント、およびイメージングのためのプロトコルについて説明します。潜在的な問題についても説明し、この手法の使用方法の例を提供します。
Introduction
不斉細胞分裂(ACD)は、RNA、タンパク質、細胞小器官などの細胞内成分が娘細胞間で不均等に分配されるプロセスです1,2。このプロセスは、ACDを受けて異なる発生運命を持つ娘細胞を生じさせる幹細胞で一般的に見られます。ショウジョウバエNBは非対称に分裂して、そのステム性を保持する1つのNBと1つの神経節母細胞(GMC)を生成します。GMCは、分化ニューロンまたはグリア3を生成するためにさらなる分裂を受ける。非対称分裂NBは、3齢幼虫の発達中の脳に豊富にあり、顕微鏡で容易に観察できます。3齢幼虫期では、各中枢脳葉3,4,5,6に約100個のNBが存在する。
非対称細胞分裂は非常に動的なプロセスです。生細胞イメージングプロトコルは、細胞極性7,8,9,10、紡錘体配向11,12,13、アクトミオシン皮質のダイナミクス14,15,16,17,18、微小管および中心体生物学19,20の測定および定量化に使用されています、21、22、23、24、25、26、27、および膜10、28およびクロマチン動態29。ACDの定性的および定量的記述は、無傷の生きている脳における分割NBを画像化するための堅牢な方法とプロトコルに依存しています。以下のプロトコルは、2つの異なるマウントアプローチを使用して、in vivoで生細胞イメージングのために3齢幼虫の脳を調製、解剖、およびイメージングする方法の概要を示しています。これらの方法は、幹細胞分裂の時空間ダイナミクスや他の脳細胞の分裂に関心のある研究者に最適であり、細胞イベントの短期および長期観察を可能にします。さらに、これらの手法は、この分野の初心者でも簡単にアクセスできます。蛍光タグ付き微小管と皮質融合タンパク質を発現する幼虫の脳に対するこのアプローチの有効性と適応性を実証します。さらに、分析の方法と他の研究への応用のための考慮事項についても議論します。
Protocol
注: 図1 は、この調査を実行するために必要な資料を示しています。 1. 実験の検討と準備 幼虫が過密になるのを防ぎます。注:外植幼虫の脳の質は、解剖前の幼虫の健康と質に直接関係しています。過密から栄養失調の幼虫は、一般的に低品質の脳を生み出します30。栄養失調を避けるために、ミールキ…
Representative Results
ピン::EGFPとチェリー::木星を発現する中枢脳葉NBの解剖とイメージングこのプロトコルを紹介するために、UAS駆動のCherry::Jupiter13 と内因的にタグ付けされたPins::EGFP16 (w; worGal4、UAS-cherry::jupiter/CyO;ピン::EGFP/TM6B、Tb)を、マルチウェルイメージングスライドを用いて記載されたプロトコルを用いて4時間画像化した(図5C、<stron…
Discussion
このプロトコルは、 ショウジョウバエメラノガスター 幼虫からの生きた外植片脳のイメージングのための1つのアプローチを概説します。ここで説明するプロトコルは、適切な実験条件下で外植片脳を12〜20時間観察することを可能にする。サンプルの調製と目的の実験の設計には特別な考慮が必要です。上記のように、解剖された組織の質を決定する最も重要な要素の1つは幼虫の健?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、R35GM148160(C.C.)および国立衛生研究所(NIH)トレーニンググラントT32 GM007270(RCS)によってサポートされています
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
References
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
Cite This Article
Segura, R. C., Cabernard, C. Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains. J. Vis. Exp. (196), e65538, doi:10.3791/65538 (2023).