Værtscelleproteinanalyse ved hjælp af berigelsesperler kombineret med begrænset fordøjelse
Summary
Der præsenteres en protokol til berigelse af værtscelleproteiner (HCP’er) fra lægemiddelprodukter (DP) og påvisning af peptider ved anvendelse af proteomberigelsesperler. Metoden demonstreres ved hjælp af et egenfremstillet monoklonalt antistof (mAb) lægemiddelstof (DS), som er et velkarakteriseret referencemateriale til evaluering og sammenligning af forskellige metoder med hensyn til ydeevne.
Abstract
Værtscelleproteiner (HCP’er) er urenheder, der kan påvirke terapeutiske proteiner negativt, selv i små mængder. For at evaluere de potentielle risici forbundet med lægemidler er der udviklet metoder til at identificere sundhedspersonale med lav forekomst. En afgørende tilgang til udvikling af en følsom HCP-detektionsmetode involverer berigelse af HCP’er, samtidig med at monoklonale antistoffer (mAbs) fjernes før analyse ved hjælp af væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS).
Denne protokol giver detaljerede instruktioner til berigelse af værtscelleproteiner ved hjælp af kommercielt tilgængelige proteomberigelsesperler. Disse perler indeholder et forskelligartet bibliotek af hexapeptidligander med specifikke affiniteter for forskellige proteiner. Protokollen inkorporerer også begrænset fordøjelse og efterfølgende peptiddetektion ved hjælp af nano LC-MS / MS. Ved at anvende disse teknikker kan sundhedspersonale med lav overflod beriges over 7000 gange, hvilket resulterer i en imponerende detektionsgrænse så lav som 0,002 ppm. Det er vigtigt, at denne protokol muliggør detektion af 850 HCP’er med et højt konfidensniveau ved hjælp af en NIST mAb. Desuden er den designet til at være brugervenlig og inkluderer en videodemonstration for at hjælpe med implementeringen. Ved at følge disse trin kan forskere effektivt berige og opdage HCP’er, hvilket øger følsomheden og nøjagtigheden af risikovurderingen for lægemidler.
Introduction
Værtscelleproteiner (HCP’er) er urenheder, der frigives fra værtsorganismens cellekultur og renses sammen med monoklonalt antistof (mAb)1,2,3,4. Sporniveauer af HCP’er kan have en negativ indvirkning på kvaliteten af lægemiddelproduktet 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, og derfor ønskes en følsom HCP-analysemetode til påvisning af HCP’er i sub-ppm til ppm niveauer.
Ortogonale metoder kan anvendes til at detektere HCP’er i lav overflod. Enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) anvendes generelt til at kvantificere de samlede HCP’er, og det kan også detektere og kvantificere individuelle HCP’er, hvis de tilsvarende antistoffer er tilgængelige16. Imidlertid er produktionen af HCP-specifikke antistoffer tidskrævende og arbejdskrævende. I modsætning hertil kan væskekromatografi kombineret med massespektrometri (LC-MS) give omfattende information om individuelle HCP’er i mAb-lægemidler og anvendes bredt til HCP-identifikation 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Der er udviklet flere metoder til påvisning af HCP’er med LC-MS/MS, herunder begrænset fordøjelse20, filtrering17, protein A-deletion21, immunudfældning (IP) og ProteoMiner-berigelse (PM)18. De fleste metoder sigter mod at reducere mængden af mAb og berige HCP’er før LC-MS/MS-analyse og derved reducere det dynamiske område mellem mAb-peptider og HCP-peptider. Denne protokol præsenterer en proteomisk prøveberigelsesmetode, der kombinerer ProteoMiner-teknologi og begrænset fordøjelse (PMLD)28. ProteoMiner-berigelsesprincippet indebærer anvendelse af kommercielt tilgængelige proteomberigelsesperler, der indeholder et forskelligartet bibliotek af kombinatoriske peptidligander. Disse ligander binder specifikt til proteiner på antistof-lægemiddelprodukter, hvilket muliggør fjernelse af overskydende molekyler, mens de koncentrerer værtscelleproteiner med lav overflod (HCP’er) på deres respektive affinitetsligander. På den anden side indebærer princippet om begrænset fordøjelse anvendelse af en lav koncentration af trypsin. Denne koncentration er tilstrækkelig til at fordøje sundhedspersonale med lav forekomst, men ikke nok til at fordøje alle antistoflægemidler. Denne fremgangsmåde muliggør genvinding og berigelse af fordøjede HCP-peptider fra opløsningen.
Sammenlignet med filtreringsmetoder er PMLD-teknikken ikke begrænset af størrelsen af de påviste HCP’er17. Protein A-deletionsmetoder er specifikke til påvisning af HCP’er forbundet med antistoffer21, mens immunudfældning er begrænset til foruddefinerede HCP’er fra en bestemt cellelinje (såsom cellelinjen Chinese Hamster Ovary (CHO), hvor der blev genereret et anti-HCP-antistof4. I modsætning hertil kan PMLD anvendes til at detektere HCP’er fra ethvert lægemiddelmodul og værtscelleproteiner co-renset med lægemiddelprodukter fra forskellige cellelinjer. Derudover udviser PMLD bedre følsomhed sammenlignet med de nævnte metoder 17,18,20,21,24.
Denne fremgangsmåde kan berige HCP-koncentrationen med 7000 gange og sænke detektionsgrænsen til 0,002 ppm28. Den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er to versioner af kommercielt tilgængelige proteinberigelsesperler: den ene med en mindre kapacitet og den anden med en større kapacitet (se materialetabellen). Begge versioner af berigelsesperlerne indeholder ti preps i pakken. Producentens instruktioner tyder på, at hver prep fra det lille kapacitetssæt kan bruges til at berige 10 mg total protein. For optimal ydeevne af værtscelleprotein (HCP) berigelse fra DS er hver prep imidlertid god til fem DS-prøver. Derfor kan hvert kit bruges til at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
