Análisis de proteínas de la célula huésped mediante perlas de enriquecimiento junto con digestión limitada
Summary
Se presenta un protocolo para enriquecer proteínas de células huésped (HCP) a partir de productos farmacológicos (DP) y detectar péptidos mediante perlas de enriquecimiento de proteomas. El método se demuestra utilizando una sustancia farmacológica (DS) de anticuerpos monoclonales (mAb) de fabricación propia, que es un material de referencia bien caracterizado para evaluar y comparar diferentes métodos en términos de rendimiento.
Abstract
Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que pueden afectar negativamente a las proteínas terapéuticas, incluso en pequeñas cantidades. Para evaluar los riesgos potenciales asociados con los productos farmacéuticos, se han desarrollado métodos para identificar a los profesionales de la salud de baja abundancia. Un enfoque crucial para el desarrollo de un método sensible de detección de HCP consiste en enriquecer a los HCP y, al mismo tiempo, eliminar los anticuerpos monoclonales (mAb) antes del análisis, utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS).
Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para enriquecer las proteínas de la célula huésped utilizando perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles en el mercado. Estas perlas contienen una biblioteca diversa de ligandos hexapéptidos con afinidades específicas por diferentes proteínas. El protocolo también incorpora la digestión limitada y la posterior detección de péptidos mediante nano LC-MS/MS. Al emplear estas técnicas, los HCP con baja abundancia se pueden enriquecer más de 7000 veces, lo que resulta en un impresionante límite de detección tan bajo como 0.002 ppm. Cabe destacar que este protocolo permite la detección de 850 profesionales de la salud con un alto nivel de confianza utilizando un mAb del NIST. Además, está diseñado para ser fácil de usar e incluye una demostración en video para ayudar con su implementación. Al seguir estos pasos, los investigadores pueden enriquecer y detectar eficazmente a los profesionales de la salud, mejorando la sensibilidad y la precisión de la evaluación de riesgos de los productos farmacéuticos.
Introduction
Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que se liberan del cultivo celular del organismo huésped y se copurifican con anticuerpos monoclonales (mAb)1,2,3,4. Los niveles traza de HCP pueden afectar negativamente la calidad del producto farmacéutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto, se desea un método de análisis de HCP sensible para detectar HCP en niveles inferiores a ppm.
Se pueden aplicar métodos ortogonales para detectar HCP en baja abundancia. El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se utiliza generalmente para cuantificar los HCP generales, y también puede detectar y cuantificar los HCP individuales si se dispone de los anticuerpos correspondientes16. Sin embargo, la producción de anticuerpos específicos para el HCP requiere mucho tiempo y mano de obra. Por el contrario, la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas (LC-MS) puede proporcionar información completa sobre los HCP individuales en los medicamentos mAb y se aplica ampliamente para la identificación de HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Se han desarrollado varios métodos para detectar HCP con LC-MS/MS, incluyendo la digestión limitada20, la filtración17, la deleción de la proteína A21, la inmunoprecipitación (IP) y el enriquecimiento de ProteoMiner (PM)18. La mayoría de los métodos tienen como objetivo reducir la cantidad de anticuerpos monoclonales y enriquecer los profesionales de la salud antes del análisis de LC-MS/MS, disminuyendo así el rango dinámico entre los péptidos de anticuerpos monoclonales y los péptidos de los profesionales sanitarios. Este protocolo presenta un método de enriquecimiento proteómico de muestras que combina la tecnología ProteoMiner y la digestión limitada (PMLD)28. El principio de enriquecimiento de ProteoMiner implica el uso de perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles comercialmente que contienen una biblioteca diversa de ligandos peptídicos combinatorios. Estos ligandos se unen específicamente a las proteínas de los productos farmacológicos de anticuerpos, lo que permite la eliminación del exceso de moléculas mientras concentran las proteínas de la célula huésped (HCP) de baja abundancia en sus respectivos ligandos de afinidad. Por otro lado, el principio de digestión limitada implica el uso de una baja concentración de tripsina. Esta concentración es suficiente para digerir los profesionales de la salud de baja abundancia, pero no es suficiente para digerir todos los medicamentos de anticuerpos. Este enfoque permite la recuperación y el enriquecimiento de los péptidos HCP digeridos a partir de la solución.
En comparación con los métodos de filtración, la técnica PMLD no está limitada por el tamaño de los PS detectados17. Los métodos de deleción de la proteína A son específicos para detectar HCP asociados con anticuerpos21, mientras que la inmunoprecipitación se restringe a HCP predefinidos de una línea celular particular (como la línea celular de ovario de hámster chino (CHO)), donde se generó un anticuerpo anti-HCP4. Por el contrario, la PMLD se puede aplicar para detectar HCP de cualquier módulo farmacológico y proteínas de la célula huésped copurificadas con productos farmacológicos de varias líneas celulares. Además, la PMLD presenta una mejor sensibilidad en comparación con los métodos mencionados 17,18,20,21,24.
Este enfoque puede enriquecer la concentración de HCP en 7000 veces y reducir el límite de detección a 0,002 ppm28. La configuración experimental se ilustra en la Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos versiones de perlas de enriquecimiento de proteínas disponibles comercialmente: una con una capacidad más pequeña y la otra con una capacidad más grande (ver Tabla de materiales). Ambas versiones de las perlas de enriquecimiento contienen diez preparaciones en el paquete. Las instrucciones del fabricante sugieren que cada preparación del kit de pequeña capacidad se puede usar para enriquecer 10 mg de proteína total. Sin embargo, para un rendimiento óptimo del enriquecimiento de proteínas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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