Analyse des protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement couplées à une digestion limitée
Summary
Un protocole est présenté pour l’enrichissement des protéines de la cellule hôte (HCP) à partir de produits médicamenteux (DP) et la détection de peptides à l’aide de billes d’enrichissement du protéome. La méthode est démontrée à l’aide d’une substance médicamenteuse (DS) à base d’anticorps monoclonaux (mAb) fabriquée en interne, qui est un matériau de référence bien caractérisé pour évaluer et comparer différentes méthodes en termes de performance.
Abstract
Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui peuvent nuire aux protéines thérapeutiques, même en petites quantités. Afin d’évaluer les risques potentiels associés aux produits pharmaceutiques, des méthodes ont été mises au point pour identifier les PS de faible abondance. Une approche cruciale pour le développement d’une méthode sensible de détection des HCP consiste à enrichir les HCP tout en éliminant simultanément les anticorps monoclonaux (mAb) avant l’analyse, en utilisant la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LC-MS).
Ce protocole offre des instructions détaillées pour enrichir les protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement du protéome disponibles dans le commerce. Ces billes contiennent une bibliothèque diversifiée de ligands hexapeptidiques ayant des affinités spécifiques pour différentes protéines. Le protocole intègre également une digestion limitée et une détection ultérieure des peptides à l’aide de nano LC-MS/MS. En employant ces techniques, les PS de faible abondance peuvent être enrichis plus de 7000 fois, ce qui se traduit par une limite de détection impressionnante aussi basse que 0,002 ppm. De manière significative, ce protocole permet la détection de 850 HCP avec un haut niveau de confiance à l’aide d’un anticorps monoclonal du NIST. De plus, il est conçu pour être convivial et comprend une démonstration vidéo pour aider à sa mise en œuvre. En suivant ces étapes, les chercheurs peuvent enrichir et détecter efficacement les PS, ce qui améliore la sensibilité et la précision de l’évaluation des risques pour les produits pharmaceutiques.
Introduction
Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui sont libérées par la culture cellulaire de l’organisme hôte et co-purifiées avec des anticorps monoclonaux (anticorps monoclonaux)1,2,3,4. Des traces de PS peuvent avoir un impact négatif sur la qualité du produit pharmaceutique 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 et, par conséquent, une méthode d’analyse sensible des PS est souhaitée pour détecter les PS à des niveaux inférieurs au ppm.
Des méthodes orthogonales peuvent être appliquées pour détecter les PS en faible abondance. Le test immuno-enzymatique (ELISA) est généralement utilisé pour quantifier l’ensemble des professionnels de la santé, et il peut également détecter et quantifier les professionnels de la santé individuels si les anticorps correspondants sont disponibles16. Cependant, la production d’anticorps spécifiques au HCP prend beaucoup de temps et de main-d’œuvre. En revanche, la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) peut fournir des informations complètes sur les HCP individuels dans les produits pharmaceutiques anticlonaux et est largement appliquée pour l’identification des HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Plusieurs méthodes ont été mises au point pour détecter les professionnels de la santé avec LC-MS/MS, notamment la digestion limitée20, la filtration17, la délétion de la protéine A21, l’immunoprécipitation (IP) et l’enrichissement en protéoMiner (PM)18. La plupart des méthodes visent à réduire la quantité d’anticorps monoclonaux et à enrichir les professionnels de la santé avant l’analyse LC-MS/MS, diminuant ainsi la plage dynamique entre les peptides anticorps monoclonaux et les peptides de type HCP. Ce protocole présente une méthode d’enrichissement protéomique d’échantillons qui combine la technologie ProteoMiner et la digestion limitée (PMLD)28. Le principe d’enrichissement de ProteoMiner implique l’utilisation de billes d’enrichissement de protéome disponibles dans le commerce contenant une bibliothèque diversifiée de ligands peptidiques combinatoires. Ces ligands se lient spécifiquement aux protéines des anticorps-médicaments, ce qui permet d’éliminer les molécules en excès tout en concentrant les protéines de la cellule hôte (HCP) de faible abondance sur leurs ligands d’affinité respectifs. D’autre part, le principe de la digestion limitée implique l’utilisation d’une faible concentration de trypsine. Cette concentration est suffisante pour digérer les PS de faible abondance, mais pas assez pour digérer tous les produits médicamenteux à base d’anticorps. Cette approche permet la récupération et l’enrichissement des peptides HCP digérés à partir de la solution.
Par rapport aux méthodes de filtration, la technique PMLD n’est pas limitée par la taille des HCP détectés17. Les méthodes de délétion de la protéine A sont spécifiques à la détection des HCP associés aux anticorps21, tandis que l’immunoprécipitation est limitée aux HCP prédéfinis d’une lignée cellulaire particulière (telle que la lignée cellulaire de l’ovaire de hamster chinois (CHO)), où un anticorps anti-HCP a été généré4. En revanche, la PMLD peut être appliquée pour détecter les HCP à partir de n’importe quel module médicamenteux et des protéines de cellules hôtes co-purifiées avec des produits médicamenteux provenant de diverses lignées cellulaires. De plus, la PMLD présente une meilleure sensibilité par rapport aux méthodes mentionnées 17,18,20,21,24.
Cette approche permet d’enrichir la concentration de HCP de 7000 fois et d’abaisser la limite de détection à 0,002 ppm28. Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe deux versions de billes d’enrichissement en protéines disponibles dans le commerce : l’une avec une plus petite capacité et l’autre avec une plus grande capacité (voir le tableau des matériaux). Les deux versions des billes d’enrichissement contiennent dix préparations dans l’emballage. Les instructions du fabricant suggèrent que chaque préparation du kit de petite capacité peut être utilisée pour enrichir 10 mg de protéines totales. Cependant, pour une performance optimale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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