ניתוח חלבון התא המארח באמצעות חרוזי העשרה בשילוב עם עיכול מוגבל
Summary
מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.
Abstract
חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים שיכולים להשפיע לרעה על חלבונים טיפוליים, אפילו בכמויות קטנות. כדי להעריך את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים למוצרי תרופות, פותחו שיטות לזיהוי HCP בשפע נמוך. גישה חיונית לפיתוח שיטת זיהוי HCP רגישה כוללת העשרת HCPs ובו זמנית הסרת נוגדנים חד שבטיים (mAbs) לפני הניתוח, תוך שימוש בספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS).
פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות להעשרת חלבוני התא המאכסן באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית. חרוזים אלה מכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות הקסה-פפטידים עם זיקות ספציפיות לחלבונים שונים. הפרוטוקול משלב גם עיכול מוגבל וזיהוי פפטידים לאחר מכן באמצעות ננו LC-MS/MS. על ידי שימוש בטכניקות אלה, HCPs עם שפע נמוך ניתן להעשיר מעל 7000 פעמים, וכתוצאה מכך מגבלת זיהוי מרשימה נמוכה כמו 0.002 ppm. באופן משמעותי, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 850 HCPs עם רמה גבוהה של ביטחון באמצעות NIST mAb. יתר על כן, הוא נועד להיות ידידותי למשתמש וכולל הדגמת וידאו כדי לסייע ביישומו. על ידי ביצוע צעדים אלה, חוקרים יכולים להעשיר ולזהות ביעילות HCPs, לשפר את הרגישות והדיוק של הערכת סיכונים עבור מוצרי תרופות.
Introduction
חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים המשתחררים מתרבית התאים של האורגניזם המארח ומטוהרים במשותף עם נוגדן חד-שבטי (mAb)1,2,3,4. רמות עקבות של HCPs יכולות להשפיע לרעה על איכות מוצר התרופה 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, ולכן, שיטת ניתוח HCP רגישה רצויה כדי לזהות HCPs ברמות sub-ppm ל- ppm.
שיטות אורתוגונליות ניתן ליישם כדי לזהות HCPs בשפע נמוך. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) משמשת בדרך כלל לכימות HCPs כולל, והיא יכולה גם לזהות ולכמת HCPs בודדים אם הנוגדנים המתאימים זמינים16. עם זאת, הייצור של נוגדנים ספציפיים HCP הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. לעומת זאת, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (LC-MS) יכולה לספק מידע מקיף על HCPs בודדים במוצרי תרופות mAb והיא מיושמת באופן נרחב לזיהוי HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
מספר שיטות פותחו כדי לזהות HCPs עם LC-MS/MS, כולל עיכול מוגבל20, סינון17, חלבון A מחיקה21, משקעים חיסוניים (IP), והעשרת ProteoMiner (PM)18. רוב השיטות שואפות להפחית את כמות mAb ולהעשיר HCPs לפני ניתוח LC-MS/MS, ובכך להקטין את הטווח הדינמי בין פפטידים mAb ופפטידים HCP. פרוטוקול זה מציג שיטת העשרת דגימות פרוטאומית המשלבת טכנולוגיית ProteoMiner ועיכול מוגבל (PMLD)28. עקרון ההעשרה של ProteoMiner כולל שימוש בחרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית המכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות פפטידים קומבינטוריות. ליגנדות אלה נקשרות באופן ספציפי לחלבונים על תוצרי נוגדנים-תרופות, ומאפשרות הסרה של מולקולות עודפות תוך ריכוז חלבוני תאים מארחים בעלי שפע נמוך (HCPs) בליגנדות הזיקה שלהם. מצד שני, העיקרון של עיכול מוגבל כרוך בשימוש בריכוז נמוך של טריפסין. ריכוז זה מספיק כדי לעכל HCPs בשפע נמוך, אבל לא מספיק כדי לעכל את כל מוצרי התרופות נוגדנים. גישה זו מאפשרת שחזור והעשרה של פפטידי HCP מעוכלים מהתמיסה.
בהשוואה לשיטות סינון, טכניקת PMLD אינה מוגבלת על ידי גודל HCPs17 שזוהו. שיטות המחיקה של חלבון A הן ספציפיות לאיתור HCPs הקשורים לנוגדנים21, בעוד שמשקעים חיסוניים מוגבלים ל- HCPs מוגדרים מראש מקו תאים מסוים (כגון קו תאי השחלה של האוגר הסיני (CHO), שם נוצר נוגדן נגד HCP4. לעומת זאת, PMLD יכול להיות מיושם כדי לזהות HCPs מכל מודולי התרופה וחלבוני התא המארח מטוהרים יחד עם מוצרי תרופות מקווי תאים שונים. בנוסף, PMLD מציג רגישות טובה יותר בהשוואה לשיטות שהוזכרו 17,18,20,21,24.
גישה זו יכולה להעשיר את ריכוז HCP פי 7000 ולהוריד את מגבלת הזיהוי ל 0.002 ppm28. מערך הניסוי מומחש באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן שתי גרסאות של חרוזי העשרת חלבון הזמינים באופן מסחרי: אחת עם קיבולת קטנה יותר והשנייה עם קיבולת גדולה יותר (ראה טבלת חומרים). שתי הגרסאות של חרוזי ההעשרה מכילות עשרה פרפים באריזה. הוראות היצרן מציעות כי כל הכנה מתוך ערכת קיבולת קטנה ניתן להשתמש כדי להעשיר 10 מ”ג של חלבון כולל. עם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
