Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Lokalisierung der lncRNAs in humanen Osteosarkomzellen.
Die wichtige Rolle langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs) bei Krebs wurde untersucht, wie z. B. die Regulierung der Proliferation, des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), der Migration, der Infiltration und der Autophagie von Krebszellen. Die Lokalisationsdetektion von lncRNAs in Zellen kann Aufschluss über ihre Funktionen geben. Durch das Design der lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenz mit anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) angewendet werden, um die zelluläre Lokalisierung von lncRNAs zu detektieren. Zusammen mit der Entwicklung der Mikroskopie ermöglichen die RNA-FISH-Techniken nun sogar die Visualisierung der schlecht exprimierten lncRNAs. Mit dieser Methode kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs allein nachgewiesen werden, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine durch Verwendung von zweifarbiger oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz. Hier haben wir das detaillierte experimentelle Vorgehen und die Vorsichtsmaßnahmen von RNA FISH am Beispiel des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in menschlichen Osteosarkomzellen (143B) aufgenommen, um Forschern, die RNA-FISH-Experimente, insbesondere lncRNA-FISH, durchführen möchten, eine Referenz zu bieten.
Unser Verständnis des menschlichen Genoms hat sich durch die jüngsten Fortschritte in der Ganzgenomtechnologie erheblich erweitert. Etwa 93 % des menschlichen Genoms können in RNAs transkribiert werden, aber nur 2 % der RNAs können in Proteine übersetzt werden. Die restlichen 98 % der RNAs, die keine Proteintranslationsfunktion haben, werden als nicht-kodierende RNA (ncRNA)1 bezeichnet. Als eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) haben lange ncRNAs (lncRNAs), die über 200 Nukleotideenthalten 2, aufgrund ihrer Beteiligung an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen der Zellen, wie z. B. Differenzierung, Zykluskontrolle, Apoptose, Migration und Invasion, zunehmend Aufmerksamkeit erregt 3,4,5. LncRNAs spielen ihre Rolle durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. die Regulierung der Chromatinstruktur und der nukleären Genexpression, die Kontrolle des mRNA-Spleißprozesses und die posttranskriptionelle Modifikation6. LncRNAs regulieren das Auftreten, die Entwicklung und die Metastasierung von Malignomen sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene. Die transkriptionelle Regulation wird im Zellkern durch Beeinflussung der RNA-Transkription durch Bindung an die chromosomalen Strukturen realisiert, während die posttranskriptionelle Regulation im Zytoplasma durch die Kontrolle der Zielgene über einen endogenen kompetitiven RNA-Mechanismus (ceRNA) realisiertwird 5,7,8. CeRNA hat einen neuen Mechanismus der RNA-Interaktion aufgedeckt, nämlich dass lncRNAs wie ein Schwamm wirken können, um miRNAs zu adsorbieren und den miRNA-vermittelten Abbau verwandter Zielgene zu hemmen9. Daher ist die Information über die subzelluläre Lokalisation von lncRNAs, unabhängig davon, ob sich eine bestimmte lncRNA im Zytoplasma oder im Zellkern befindet, wichtig, um ihre biologischen Funktionen zu identifizieren.
Gegenwärtig wird die lncRNA-Lokalisierung hauptsächlich mit zwei Methoden nachgewiesen, eine durch Zellkern-/Zytoplasmafraktions-Isolierungsassay und die andere durch RNA-FISH. Im ersten Fall werden RNAs in der zytoplasmatischen bzw. der nukleären Fraktion extrahiert, und dann wird eine PCR-Amplifikation mit spezifischen lncRNA-Primern durchgeführt, um das Verhältnis von lncRNAs im Zytoplasma und Zellkern nachzuweisen. Der Vorteil dieser Methode ist die Zeiteffizienz, während der Nachteil darin besteht, dass sich die tatsächliche lncRNA-Lokalisierung nicht direkt durch den relativen Anteil der lncRNAs im Zytoplasma und Zellkern widerspiegelt. RNA FISH kann die Lokalisierung von lncRNA in Zellen durch das Design von lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenzen und anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen nachweisen10. Die RNA-FISH-Methoden wurden mit Fortschritten in den Sondentechniken und Nachweismethoden verbessert, einschließlich Fluorophor-markierter multipler Oligo-Sondensätze11, LNA-Sonden 12 und verzweigter DNA (bDNA)-Sonden13. RNA FISH kann nicht nur die Lokalisation von lncRNA nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine mithilfe von zwei- oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz14.
In dieser Arbeit haben wir das detaillierte intrazelluläre Lokalisationsdetektionsprotokoll des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in Osteosarkomzellen (143B) durch RNA FISH als Beispiel einbezogen. SNHG6 ist eine 600-730 Nukleotid-lncRNA in ihrer reifen gespleißten Form und wurde als neues Onkogen bei verschiedenen menschlichen Krebsarten identifiziert, darunter Darmkrebs, Magenkrebs, klarzelliges Ovarialkarzinom, Osteosarkom und hepatozelluläres Karzinom15,16,17,18. Studien haben die Beteiligung von SNHG6 an biologischen Verhaltensweisen von Krebszellen wie Proliferation, EMT und Autophagie bestätigt und die zytoplasmatische Lokalisation von SNHG6 gezeigt, wo es die Zielgene beeinflussen kann, indem es die miRNAs bindet (schwammt)15,16,17. Dieses detaillierte Detektionsprotokoll der intrazellulären Lokalisierung von SNHG6 durch RNA FISH wird hier vorgestellt.
Dieses RNA-FISH-Protokoll kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs in Zellen nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine in Zellen, was auch zum Nachweis der Lokalisation von lncRNAs in paraffineingebetteten Geweben verwendet werden kann. Das spezifische Protokoll in solchen Fällen ist jedoch anders, da die in Paraffin eingebetteten Gewebe entwachst werden müssen21. Dieses experimentelle Verfahren kann in 48- oder 96-Well-Platten angewendet werden, aber 384-We…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschüsse von (1) dem National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) die National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Forschungsprojekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |