Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano
Summary
El presente protocolo describe un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN para localizar los lncRNAs en células de osteosarcoma humano.
Abstract
Se han estudiado las funciones importantes de los ARN largos no codificantes (ARNnc) en el cáncer, como la regulación de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la migración, la infiltración y la autofagia de las células cancerosas. La detección de localización de lncRNAs en las células puede proporcionar información sobre sus funciones. Mediante el diseño de la secuencia de cadena antisentido específica de lncRNA seguida de marcaje con colorantes fluorescentes, se puede aplicar la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para detectar la localización celular de lncRNAs. Junto con el desarrollo de la microscopía, las técnicas de ARN FISH permiten ahora incluso la visualización de los lncRNAs mal expresados. Este método no solo puede detectar la localización de lncRNAs por sí solo, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor. Aquí, hemos incluido el procedimiento de operación experimental detallado y las precauciones de ARN FISH mediante el uso del gen huésped de ARN nucleolar pequeño de lncRNA 6 (SNHG6) en células de osteosarcoma humano (143B) como ejemplo, para proporcionar una referencia para los investigadores que desean realizar experimentos de ARN FISH, especialmente lncRNA FISH.
Introduction
Nuestra comprensión del genoma humano se ha ampliado enormemente gracias a los recientes avances en la tecnología del genoma completo. Alrededor del 93% del genoma humano se puede transcribir en ARN, pero solo el 2% de los ARN se pueden traducir en proteínas; el 98% restante de los ARN que no tienen función de traducción de proteínas se denominan ARN no codificante (ncRNA)1. Como una clase de ARN no codificantes (ncRNAs), los ncRNAs largos (lncRNAs), que contienen más de 200 nucleótidos2, han atraído cada vez más atención debido a su participación en muchos procesos fisiológicos y patológicos de las células, como la diferenciación, el control del ciclo, la apoptosis, la migración y la invasión 3,4,5. Los LncRNAs desempeñan sus funciones a través de diversos mecanismos, como la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica nuclear, el control del proceso de empalme del ARNm y la modificación postranscripcional6. Los LncRNAs regulan la aparición, el desarrollo y la metástasis de las neoplasias malignas tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. La regulación transcripcional se realiza en el núcleo afectando la transcripción del ARN a través de la unión a las estructuras cromosómicas, mientras que la regulación postranscripcional se realiza en el citoplasma mediante el control de los genes diana a través de un mecanismo endógeno de ARN competitivo (ARNce) 5,7,8. El CeRNA ha revelado un nuevo mecanismo de interacción del ARN, a saber, que los lncRNAs pueden actuar como una esponja para adsorber miRNAs e inhibir la degradación mediada por miRNAsde genes diana relacionados. Por lo tanto, la información sobre la localización subcelular de los lncRNAs, ya sea que un lncRNA específico se encuentre en el citoplasma o en el núcleo, es importante para ayudar a identificar sus funciones biológicas.
En la actualidad, la localización de lncRNA se detecta principalmente mediante dos métodos, uno es mediante el ensayo de aislamiento de la fracción de núcleo/citoplasma y el otro es mediante ARN FISH. En el primero, se extraen los ARN de las fracciones citoplasmática y nuclear respectivamente, y luego se realiza la amplificación por PCR con cebadores específicos de lncRNA para detectar la proporción de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. La ventaja de este método es la eficiencia del tiempo, mientras que la desventaja es que la localización real del lncRNA no se refleja directamente en la proporción relativa de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. RNA FISH puede detectar la localización de lncRNA en las células mediante el diseño de secuencias de cadenas antisentido específicas de lncRNA seguidas de marcaje con colorantes fluorescentes10. Los métodos FISH de ARN se han mejorado con avances en las técnicas de sonda y los métodos de detección, incluidos los conjuntos de sondas de múltiples oligonucleótidosmarcados con fluoróforos 11, las sondas LNA 12 y las sondas de ADN ramificado (ADNb)13. RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNA, sino también detectar la colocalización de otros ARN, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor14.
En este trabajo, hemos incluido como ejemplo el protocolo detallado de detección de localización intracelular del gen huésped de ARN nucleolar pequeño 6 (SNHG6) de lncRNA en células de osteosarcoma (143B) mediante ARN FISH. SNHG6 es un lncRNA de 600-730 nucleótidos en su forma madura empalmada e identificado como un nuevo oncogén en diversos cánceres humanos, incluido el cáncer colorrectal, el cáncer gástrico, el carcinoma de células claras de ovario, el osteosarcoma y el carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Los estudios han confirmado la participación de SNHG6 en los comportamientos biológicos de las células cancerosas, como la proliferación, la EMT y la autofagia, y han demostrado la localización citoplasmática de SNHG6 donde puede afectar a los genes diana mediante la unión (esponja) de los miRNAs15,16,17. En este documento se presenta este protocolo detallado de detección de la localización intracelular de SNHG6 mediante ARN FISH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNAs en las células, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas en las células, que también se pueden utilizar para detectar la ubicación de lncRNAs en tejidos embebidos en parafina. Sin embargo, el protocolo específico en estos casos es diferente porque los tejidos embebidos en parafina necesitan ser desparafinados21. Este procedimiento experimental se puede aplicar en placas de 48 o 96 pocil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de (1) el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFE0201600); (2) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408); (3) Centro de Innovación Colaborativa de Shanghái de Transformación Industrial de Preparación de MTC Hospitalaria; (4) Proyectos de investigación dentro del presupuesto de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
