RNA-fluorescens in situ-hybridisering för lång icke-kodande RNA-lokalisering i humana osteosarkomceller

Summary

Det aktuella protokollet beskriver en metod för RNA-fluorescens in situ-hybridisering för att lokalisera lncRNA i humana osteosarkomceller.

Abstract

De viktiga rollerna för långa icke-kodande RNA (lncRNA) i cancer har studerats, såsom reglering av proliferation, epitelial-mesenkymal övergång (EMT), migration, infiltration och autofagi av cancerceller. Lokaliseringsdetektion av lncRNA i celler kan ge insikt i deras funktioner. Genom att designa den lncRNA-specifika antisenskedjesekvensen följt av märkning med fluorescerande färgämnen kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) tillämpas för att detektera den cellulära lokaliseringen av lncRNA. Tillsammans med utvecklingen av mikroskopi möjliggör RNA FISH-teknikerna nu även visualisering av de dåligt uttryckta lncRNA:erna. Denna metod kan inte bara detektera lokaliseringen av enbart lncRNA, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner genom att använda dubbel- eller flerfärgad immunofluorescens. Här har vi inkluderat den detaljerade experimentella operationsproceduren och försiktighetsåtgärderna för RNA FISH genom att använda lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) i humana osteosarkomceller (143B) som ett exempel, för att ge en referens för forskare som vill utföra RNA FISH-experiment, särskilt lncRNA FISH.

Introduction

Vår förståelse av det mänskliga genomet har utökats kraftigt av de senaste framstegen inom helgenomteknik. Cirka 93 % av det mänskliga genomet kan transkriberas till RNA, men endast 2 % av RNA kan översättas till proteiner; de återstående 98 % av RNA som inte har någon proteintranslationsfunktion kallas icke-kodande RNA (ncRNA)¹. Som en klass av icke-kodande RNA (ncRNA) har långa ncRNA (lncRNA), som innehåller över 200 nukleotider², väckt ökad uppmärksamhet på grund av deras inblandning i många fysiologiska och patologiska processer i cellerna, såsom differentiering, cykelkontroll, apoptos, migration och invasion ^3,4,5. LncRNA spelar sina roller genom olika mekanismer, såsom reglering av kromatinstruktur och nukleärt genuttryck, kontroll av mRNA-splitsningsprocessen och posttranskriptionell modifiering⁶. LncRNA reglerar förekomst, utveckling och metastasering av maligniteter på både transkriptions- och posttranskriptionsnivå. Transkriptionell reglering realiseras i kärnan genom att påverka RNA-transkription via bindning till kromosomstrukturerna, medan posttranskriptionell reglering realiseras i cytoplasman genom att kontrollera målgenerna via en endogen kompetitiv RNA (ceRNA) mekanism ^5,7,8. CeRNA har avslöjat en ny mekanism för RNA-interaktion, nämligen att lncRNA kan fungera som en svamp för att adsorbera miRNA och hämma den miRNA-medierade nedbrytningen av relaterade målgener⁹. Därför är informationen om den subcellulära lokaliseringen av lncRNA, oavsett om ett specifikt lncRNA finns i cytoplasman eller kärnan, viktigt för att hjälpa till att identifiera deras biologiska funktioner.

För närvarande detekteras lncRNA-lokalisering huvudsakligen med två metoder, den ena är genom cellkärna/cytoplasmafraktionsisoleringsanalys, och den andra är med RNA-fisk. I den förstnämnda extraheras RNA i cytoplasman respektive kärnfraktionerna, och sedan utförs PCR-amplifiering med specifika lncRNA-primrar för att detektera förhållandet mellan lncRNA i cytoplasman och kärnan. Fördelen med denna metod är tidseffektiviteten, medan nackdelen är att den faktiska lncRNA-lokaliseringen inte direkt återspeglas av den relativa andelen lncRNA i cytoplasman och kärnan. RNA FISH kan detektera lncRNA-lokalisering i celler genom design av lncRNA-specifika antisenskedjesekvenser följt av märkning med fluorescerande färgämnen¹⁰. RNA FISH-metoderna har förbättrats med framsteg inom sondteknik och detektionsmetoder, inklusive fluoroformärkta multipla oligosonduppsättningar¹¹, LNA-sonder¹² och grenade DNA-sonder (bDNA)¹³. RNA FISH kan inte bara detektera lokaliseringen av lncRNA, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner genom att använda dubbel- eller flerfärgad immunofluorescens¹⁴.

I detta arbete har vi inkluderat det detaljerade intracellulära lokaliseringsdetektionsprotokollet för lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) med RNA FISH som ett exempel. SNHG6 är ett 600-730 nukleotid-lncRNA i sin mogna splitsade form och identifierad som en ny onkogen i olika mänskliga cancerformer, inklusive kolorektal cancer, magcancer, ovariellt klarcellscancer, osteosarkom och hepatocellulärt karcinom^15,16,17,18. Studier har bekräftat att SNHG6 är involverat i cancercellers biologiska beteenden, såsom proliferation, EMT och autofagi, och visat den cytoplasmatiska lokaliseringen av SNHG6 där den kan påverka målgenerna genom att binda (svampa) miRNA^15,16,17. Detta detaljerade detektionsprotokoll för SNHG6 intracellulär lokalisering med RNA FISH presenteras här.

Protocol

Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll. Figur 1 visar det övergripande protokollet för RNA-fisk. Tabell 1 innehåller sammansättningen av alla lösningar och tabell 2 innehåller de primersekvenser som används i detta protokoll. 1. Förberedelse av sond Identifiera och förvärva FASTA-sekvensen av ett mål-lncRNA a…

Representative Results

Representativa bilder av SNHG6 FISH i humana osteosarkomceller visas (figur 2). Den negativa kontrollen behandlas med den negativa Ctrl-avsökningen. positiv kontroll behandlas med U6 sond 20. SNHG6-sonden och U6-sonden är märkta med Cy3, som avger röd fluorescens. DAPI är ett färgämne som färgar DNA:t, vilket avger blå fluorescens. Detta resultat visar att SNHG6 huvudsakligen är lokaliserat i cytoplasman, och denna information kan ge en viktig riktning för …

Discussion

Detta RNA FISH-protokoll kan inte bara detektera lokaliseringen av lncRNA i celler, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner i celler, som också kan användas för att detektera placeringen av lncRNA i paraffininbäddade vävnader. Det specifika protokollet i sådana fall är dock annorlunda eftersom de paraffininbäddade vävnaderna måste avvaxas²¹. Denna experimentella procedur kan tillämpas på plattor med 48 eller 96 brunnar, men plattor med 384 brunnar är …

Materials

Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent