RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA כדי למקם את lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים.
Abstract
התפקידים החשובים של RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs) בסרטן נחקרו, כגון ויסות ההתפשטות, מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), הגירה, חדירה ואוטופגיה של תאים סרטניים. זיהוי לוקליזציה של lncRNA בתאים יכול לספק תובנה לגבי תפקודיהם. על ידי תכנון רצף שרשרת האנטיסנס הספציפי ל-lncRNA ואחריו תיוג בצבעים פלואורסצנטיים, ניתן ליישם הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA (FISH) כדי לזהות את הלוקליזציה התאית של lncRNAs. יחד עם התפתחות המיקרוסקופ, טכניקות RNA FISH מאפשרות כעת אפילו הדמיה של lncRNA מבוטא בצורה גרועה. שיטה זו יכולה לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA לבד, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNA אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או multicolor immunofluorescence. כאן, כללנו את הליך הפעולה הניסויי המפורט ואת אמצעי הזהירות של RNA FISH באמצעות lncRNA גרעין קטן RNA מארח גן 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (143B) כדוגמה, כדי לספק התייחסות לחוקרים שרוצים לבצע ניסויים RNA FISH, במיוחד lncRNA דגים.
Introduction
הבנתנו את הגנום האנושי הורחבה מאוד על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הגנום השלם. כ-93% מהגנום האנושי ניתן לשעתוק לרנ”א, אך רק 2% מהרנ”א ניתן לתרגם לחלבונים; 98% הנותרים של RNA שאין להם פונקציית תרגום חלבונים נקראים RNA לא מקודד (ncRNA)1. כקבוצה של רנ”א לא מקודד (ncRNAs), ncRNA ארוך (lncRNAs), המכיל מעל 200 נוקלאוטידים2, משכו תשומת לב גוברת בשל מעורבותם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של התאים, כגון התמיינות, בקרת מחזור, אפופטוזיס, הגירה ופלישה 3,4,5. LncRNA ממלאים את תפקידם באמצעות מנגנונים שונים, כגון ויסות מבנה הכרומטין וביטוי גנים גרעיניים, שליטה בתהליך השחבור mRNA, ושינוי לאחר שעתוק6. LncRNAs מווסתים את ההתרחשות, ההתפתחות והגרורות של ממאירויות הן ברמת השעתוק והן ברמת השעתוק שלאחר השעתוק. ויסות השעתוק מתממש בגרעין על ידי השפעה על שעתוק RNA באמצעות קשירה למבנים הכרומוזומליים, בעוד שהוויסות שלאחר השעתוק מתממש בציטופלסמה על ידי שליטה בגני המטרה באמצעות מנגנון RNA תחרותי אנדוגני(ceRNA) 5,7,8. CeRNA חשפה מנגנון חדש של אינטראקציית RNA, כלומר ש-lncRNA יכול לשמש כספוג כדי לספוח miRNA ולעכב את הפירוק בתיווך miRNA של גני מטרה קשורים9. לכן, המידע לגבי לוקליזציה תת-תאית של lncRNAs, האם lncRNA מסוים ממוקם בציטופלסמה או בגרעין, חשוב כדי לסייע בזיהוי הפונקציות הביולוגיות שלהם.
כיום, לוקליזציה של lncRNA מזוהה בעיקר על ידי שתי שיטות, האחת היא על ידי בדיקת בידוד שברים גרעין/ציטופלסמה, והשנייה היא על ידי RNA FISH. בראשון, RNAs בשברים הציטופלזמיים והגרעיניים מופקים בהתאמה, ולאחר מכן הגברה PCR מבוצעת עם פריימרים ספציפיים lncRNA כדי לזהות את היחס של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. היתרון של שיטה זו הוא יעילות הזמן, בעוד החיסרון הוא כי לוקליזציה lncRNA בפועל אינו משתקף ישירות על ידי החלק היחסי של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. RNA FISH יכול לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים באמצעות תכנון רצפי שרשרת אנטיסנס ספציפיים ל-lncRNA ולאחר מכן תיוג בצבעים פלואורסצנטיים10. שיטות RNA FISH שופרו עם התקדמות בטכניקות בדיקה ושיטות זיהוי, כולל ערכות בדיקה מרובות אוליגו11 המסומנות בפלואורופור, בדיקות LNA 12 ובדיקות DNA מסועף (bDNA)13. RNA FISH יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או צבעוני immunofluorescence14.
בעבודה זו, כללנו את פרוטוקול זיהוי הלוקליזציה התוך-תאי המפורט של lncRNA גן מארח גרעין קטן RNA 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה (143B) על ידי RNA FISH כדוגמה. SNHG6 הוא lncRNA נוקלאוטיד 600-730 בצורתו השחבור הבוגר ומזוהה כאונקוגן חדשני במגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל סרטן המעי הגס, סרטן קיבה, קרצינומה של תאים צלולים בשחלות, אוסטאוסרקומה וקרצינומה הפטוצלולרית15,16,17,18. מחקרים אישרו את מעורבותו של SNHG6 בהתנהגויות ביולוגיות של תאים סרטניים, כגון התפשטות, EMT ואוטופגיה, והראו לוקליזציה ציטופלזמית של SNHG6 שם הוא עשוי להשפיע על גני המטרה על ידי קשירה (ספוג) של miRNA15,16,17. פרוטוקול זיהוי מפורט זה של לוקליזציה תוך-תאית SNHG6 על ידי RNA FISH מוצג כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול RNA FISH זה יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים, אלא גם לזהות את הקולוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים בתאים, אשר יכול לשמש גם כדי לזהות את המיקום של lncRNA ברקמות משובצות פרפין. עם זאת, הפרוטוקול הספציפי במקרים כאלה שונה מכיוון שהרקמות המשובצות בפרפין צריכות להיות בשעווה21…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ (1) תוכנית המו”פ הלאומית של סין (2020YFE0201600); (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408); (3) מרכז שנגחאי לחדשנות שיתופית של טרנספורמציה תעשייתית של הכנת TCM בבית חולים; (4) פרויקטים מחקריים במסגרת תקציב אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
