Hibridização in situ por fluorescência de RNA para localização de RNA longo e não codificante em células de osteossarcoma humano
Summary
O presente protocolo descreve um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA para localizar os lncRNAs em células humanas de osteossarcoma.
Abstract
Os papéis importantes dos RNAs longos não-codificadores (lncRNAs) no câncer têm sido estudados, tais como a regulação da proliferação, transição epitélio-mesenquimal (EMT), migração, infiltração e autofagia de células cancerosas. A detecção de localização de lncRNAs em células pode fornecer informações sobre suas funções. Ao projetar a sequência de cadeia antisense específica para lncRNA seguida de marcação com corantes fluorescentes, a hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) pode ser aplicada para detectar a localização celular de lncRNAs. Juntamente com o desenvolvimento da microscopia, as técnicas de RNA FISH agora permitem até mesmo a visualização dos lncRNAs mal expressos. Este método pode não só detectar a localização de lncRNAs sozinho, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA, ou proteínas usando imunofluorescência de cor dupla ou multicolorida. Aqui, incluímos o procedimento detalhado de operação experimental e precauções de RNA FISH usando lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) em células humanas de osteossarcoma (143B) como um exemplo, para fornecer uma referência para pesquisadores que desejam realizar experimentos de RNA FISH, especialmente lncRNA FISH.
Introduction
Nossa compreensão do genoma humano tem sido grandemente expandida pelos recentes avanços na tecnologia do genoma completo. Cerca de 93% do genoma humano pode ser transcrito em RNAs, mas apenas 2% dos RNAs podem ser traduzidos em proteínas; os 98% restantes dos RNAs que não têm função de tradução de proteínas são chamados de RNA não codificantes (ncRNA)1. Como uma classe de RNAs não codificantes (ncRNAs), os ncRNAs longos (lncRNAs), contendo mais de 200 nucleotídeos2, têm atraído atenção crescente devido ao seu envolvimento em muitos processos fisiológicos e patológicos das células, como diferenciação, controle do ciclo, apoptose, migração e invasão 3,4,5 . Os LncRNAs desempenham seu papel através de vários mecanismos, tais como regulação da estrutura da cromatina e expressão gênica nuclear, controle do processo de splicing de RNAm e modificação pós-transcricional6. Os LncRNAs regulam a ocorrência, o desenvolvimento e a metástase de malignidades em ambos os níveis transcricional e pós-transcricional. A regulação transcricional é realizada no núcleo por afetar a transcrição do RNA via ligação às estruturas cromossômicas, enquanto a regulação pós-transcricional é realizada no citoplasma pelo controle dos genes-alvo via mecanismo endógeno competitivo de RNA (ceRNA)5,7,8. O CeRNA revelou um novo mecanismo de interação de RNA, a saber, que os lncRNAs podem atuar como uma esponja para adsorver miRNAs e inibir a degradação mediada por miRNA de genes-alvorelacionados9. Portanto, as informações sobre a localização subcelular dos lncRNAs, se um lncRNA específico está localizado no citoplasma ou no núcleo, são importantes para ajudar a identificar suas funções biológicas.
Atualmente, a localização do lncRNA é detectada principalmente por dois métodos, um é por ensaio de isolamento da fração núcleo/citoplasma e o outro é por RNA FISH. No primeiro, os RNAs nas frações citoplasmática e nuclear são extraídos respectivamente e, em seguida, a amplificação por PCR é realizada com primers específicos de lncRNA para detectar a proporção de lncRNAs no citoplasma e núcleo. A vantagem deste método é a eficiência do tempo, enquanto a desvantagem é que a localização real do lncRNA não é diretamente refletida pela proporção relativa de lncRNAs no citoplasma e núcleo. RNA FISH pode detectar a localização de lncRNA em células através do planejamento de sequências de cadeia antisense específicas para lncRNA seguidas de marcação com corantes fluorescentes10. Os métodos de RNA FISH foram aprimorados com os avanços nas técnicas de sonda e métodos de detecção, incluindo conjuntos de múltiplas sondas oligo marcadas com fluoróforos11, sondas LNA 12 e sondas de DNA ramificado (bDNA)13. RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNA, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas usando imunofluorescência de dupla cor ou multicolorida14.
Neste trabalho, incluímos como exemplo o protocolo detalhado de detecção de localização intracelular do gene 6 do RNA nucleolar pequeno RNA do lncRNA (SNHG6) em células de osteossarcoma (143B) por RNA FISH. SNHG6 é um lncRNA de nucleotídeo 600-730 em sua forma spliced madura e identificado como um novo oncogene em diversos cânceres humanos, incluindo câncer colorretal, câncer gástrico, carcinoma de células claras do ovário, osteossarcoma e carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Estudos têm confirmado o envolvimento do SNHG6 em comportamentos biológicos de células cancerosas, como proliferação, EMT e autofagia, e demonstrado a localização citoplasmática do SNHG6 onde ele pode afetar os genes alvo por ligação (esponja) aos miRNAs15,16,17. Este protocolo detalhado de detecção da localização intracelular do SNHG6 por RNA FISH é apresentado neste artigo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNAs em células, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas nas células, que também podem ser usados para detectar a localização de lncRNAs em tecidos embebidos em parafina. Entretanto, o protocolo específico nesses casos é diferente, pois os tecidos emblocados em parafina necessitam ser desparafinados21. Este procedimento experimental pode ser aplicado em placas de 48 ou 96 poços, mas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado por subsídios de (1) o Programa Nacional de P&D da China (2020YFE0201600); (2) a National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Projetos de Pesquisa dentro do Orçamento da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
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