Флуоресцентная гибридизация РНК in situ для длительной некодирующей локализации РНК в клетках остеосаркомы человека
Summary
В настоящем протоколе описан метод флуоресцентной гибридизации РНК in situ для локализации днкРНК в клетках остеосаркомы человека.
Abstract
Изучена важная роль длинных некодирующих РНК (днкРНК) в раке, такая как регуляция пролиферации, эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), миграция, инфильтрация и аутофагия раковых клеток. Локализация днкРНК в клетках может дать представление об их функциях. Путем разработки последовательности антисмысловой цепи, специфичной для днкРНК, с последующим мечением флуоресцентными красителями, флуоресцентная гибридизация РНК in situ (FISH) может быть применена для обнаружения клеточной локализации днкРНК. Вместе с развитием микроскопии методы RNA FISH теперь позволяют визуализировать даже плохо экспрессируемые днкРНК. Этот метод позволяет не только обнаружить локализацию только днкРНК, но и обнаружить колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции. Здесь мы включили подробную процедуру экспериментальной эксплуатации и меры предосторожности RNA FISH на примере lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) в клетках остеосаркомы человека (143B), чтобы обеспечить справочную информацию для исследователей, которые хотят проводить эксперименты с РНК FISH, особенно с lncRNA FISH.
Introduction
Наше понимание генома человека значительно расширилось благодаря недавним достижениям в области полногеномных технологий. Около 93% генома человека могут быть транскрибированы в РНК, но только 2% РНК могут быть транстранслированы в белки; остальные 98% РНК, которые не имеют функции трансляции белков, называются некодирующими РНК (нРНК)1. Как класс некодирующих РНК (нРНК), длинные нРНК (днкРНК), содержащие более 200 нуклеотидов2, привлекают все большее внимание в связи с их участием во многих физиологических и патологических процессах клеток, таких как дифференцировка, контроль цикла, апоптоз, миграция и инвазия 3,4,5 . LncRNA играют свою роль через различные механизмы, такие как регуляция структуры хроматина и экспрессии ядерных генов, контроль процесса сплайсинга мРНК и посттранскрипционная модификация6. ДнкРНК регулируют возникновение, развитие и метастазирование злокачественных новообразований как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. Транскрипционная регуляция реализуется в ядре путем воздействия на транскрипцию РНК через связывание с хромосомными структурами, в то время как посттранскрипционная регуляция осуществляется в цитоплазме путем управления генами-мишенями через механизм эндогенной конкурентной РНК (цРНК) 5,7,8. CeRNA выявила новый механизм взаимодействия РНК, а именно, что днкРНК могут действовать как губка, адсорбируя микроРНК и ингибируя опосредованную микроРНК деградацию родственных генов-мишеней9. Таким образом, информация о субклеточной локализации днкРНК, независимо от того, находится ли конкретная днкРНК в цитоплазме или ядре, важна для определения их биологических функций.
В настоящее время локализация днкРНК в основном определяется двумя методами: методом выделения фракции ядра/цитоплазмы и РНК FISH. В первом случае выделяют РНК в цитоплазматической и ядерной фракциях соответственно, а затем проводят ПЦР-амплификацию со специфическими праймерами днкРНК для определения соотношения днкРНК в цитоплазме и ядре. Преимуществом этого метода является экономия времени, в то время как недостатком является то, что фактическая локализация днкРНК не отражается напрямую на относительной доле днкРНК в цитоплазме и ядре. РНК FISH может обнаруживать локализацию днкРНК в клетках путем разработки специфичных для днкРНК антисмысловых цепных последовательностей с последующим мечением флуоресцентными красителями10. Методы RNA FISH были усовершенствованы благодаря достижениям в области зондовых техник и методов обнаружения, включая множественные наборы олигозондов, меченные флуорофорами11, зонды LNA 12 и зонды с разветвленной ДНК (бДНК)13. RNA FISH может не только обнаруживать локализацию lncRNA, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции14.
В данной работе в качестве примера был включен подробный протокол обнаружения внутриклеточной локализации малоядрышковой РНК гена хозяина 6 (SNHG6) lncRNA в клетках остеосаркомы (143B) с помощью РНК FISH. SNHG6 представляет собой 600-730 нуклеотидную днкРНК в зрелой сплайсированной форме и идентифицирован как новый онкоген при различных видах рака человека, включая колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточную карциному яичников, остеосаркому и гепатоцеллюлярную карциному15,16,17,18. Исследования подтвердили участие SNHG6 в биологическом поведении раковых клеток, таком как пролиферация, ЭМП и аутофагия, и показали цитоплазматическую локализацию SNHG6, где он может влиять на гены-мишени путем связывания (губирования) микроРНК15,16,17. В статье представлен подробный протокол детектирования внутриклеточной локализации SNHG6 с помощью РНК FISH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол RNA FISH может не только обнаруживать локализацию днкРНК в клетках, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков в клетках, что также может быть использовано для обнаружения местоположения днкРНК в тканях, погруженных в парафин. Однако конкретный протокол в так?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддержана грантами (1) Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2020YFE0201600); (2) Национальный фонд естественных наук (81973877 и 82174408); (3) Шанхайский совместный инновационный центр промышленной трансформации подготовки к ТКМ в больницах; (4) Исследовательские проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
