Det aktuella protokollet beskriver en metod för RNA-fluorescens in situ-hybridisering för att lokalisera lncRNA i humana osteosarkomceller.
De viktiga rollerna för långa icke-kodande RNA (lncRNA) i cancer har studerats, såsom reglering av proliferation, epitelial-mesenkymal övergång (EMT), migration, infiltration och autofagi av cancerceller. Lokaliseringsdetektion av lncRNA i celler kan ge insikt i deras funktioner. Genom att designa den lncRNA-specifika antisenskedjesekvensen följt av märkning med fluorescerande färgämnen kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) tillämpas för att detektera den cellulära lokaliseringen av lncRNA. Tillsammans med utvecklingen av mikroskopi möjliggör RNA FISH-teknikerna nu även visualisering av de dåligt uttryckta lncRNA:erna. Denna metod kan inte bara detektera lokaliseringen av enbart lncRNA, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner genom att använda dubbel- eller flerfärgad immunofluorescens. Här har vi inkluderat den detaljerade experimentella operationsproceduren och försiktighetsåtgärderna för RNA FISH genom att använda lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) i humana osteosarkomceller (143B) som ett exempel, för att ge en referens för forskare som vill utföra RNA FISH-experiment, särskilt lncRNA FISH.
Vår förståelse av det mänskliga genomet har utökats kraftigt av de senaste framstegen inom helgenomteknik. Cirka 93 % av det mänskliga genomet kan transkriberas till RNA, men endast 2 % av RNA kan översättas till proteiner; de återstående 98 % av RNA som inte har någon proteintranslationsfunktion kallas icke-kodande RNA (ncRNA)1. Som en klass av icke-kodande RNA (ncRNA) har långa ncRNA (lncRNA), som innehåller över 200 nukleotider2, väckt ökad uppmärksamhet på grund av deras inblandning i många fysiologiska och patologiska processer i cellerna, såsom differentiering, cykelkontroll, apoptos, migration och invasion 3,4,5. LncRNA spelar sina roller genom olika mekanismer, såsom reglering av kromatinstruktur och nukleärt genuttryck, kontroll av mRNA-splitsningsprocessen och posttranskriptionell modifiering6. LncRNA reglerar förekomst, utveckling och metastasering av maligniteter på både transkriptions- och posttranskriptionsnivå. Transkriptionell reglering realiseras i kärnan genom att påverka RNA-transkription via bindning till kromosomstrukturerna, medan posttranskriptionell reglering realiseras i cytoplasman genom att kontrollera målgenerna via en endogen kompetitiv RNA (ceRNA) mekanism 5,7,8. CeRNA har avslöjat en ny mekanism för RNA-interaktion, nämligen att lncRNA kan fungera som en svamp för att adsorbera miRNA och hämma den miRNA-medierade nedbrytningen av relaterade målgener9. Därför är informationen om den subcellulära lokaliseringen av lncRNA, oavsett om ett specifikt lncRNA finns i cytoplasman eller kärnan, viktigt för att hjälpa till att identifiera deras biologiska funktioner.
För närvarande detekteras lncRNA-lokalisering huvudsakligen med två metoder, den ena är genom cellkärna/cytoplasmafraktionsisoleringsanalys, och den andra är med RNA-fisk. I den förstnämnda extraheras RNA i cytoplasman respektive kärnfraktionerna, och sedan utförs PCR-amplifiering med specifika lncRNA-primrar för att detektera förhållandet mellan lncRNA i cytoplasman och kärnan. Fördelen med denna metod är tidseffektiviteten, medan nackdelen är att den faktiska lncRNA-lokaliseringen inte direkt återspeglas av den relativa andelen lncRNA i cytoplasman och kärnan. RNA FISH kan detektera lncRNA-lokalisering i celler genom design av lncRNA-specifika antisenskedjesekvenser följt av märkning med fluorescerande färgämnen10. RNA FISH-metoderna har förbättrats med framsteg inom sondteknik och detektionsmetoder, inklusive fluoroformärkta multipla oligosonduppsättningar11, LNA-sonder12 och grenade DNA-sonder (bDNA)13. RNA FISH kan inte bara detektera lokaliseringen av lncRNA, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner genom att använda dubbel- eller flerfärgad immunofluorescens14.
I detta arbete har vi inkluderat det detaljerade intracellulära lokaliseringsdetektionsprotokollet för lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) med RNA FISH som ett exempel. SNHG6 är ett 600-730 nukleotid-lncRNA i sin mogna splitsade form och identifierad som en ny onkogen i olika mänskliga cancerformer, inklusive kolorektal cancer, magcancer, ovariellt klarcellscancer, osteosarkom och hepatocellulärt karcinom15,16,17,18. Studier har bekräftat att SNHG6 är involverat i cancercellers biologiska beteenden, såsom proliferation, EMT och autofagi, och visat den cytoplasmatiska lokaliseringen av SNHG6 där den kan påverka målgenerna genom att binda (svampa) miRNA15,16,17. Detta detaljerade detektionsprotokoll för SNHG6 intracellulär lokalisering med RNA FISH presenteras här.
Detta RNA FISH-protokoll kan inte bara detektera lokaliseringen av lncRNA i celler, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner i celler, som också kan användas för att detektera placeringen av lncRNA i paraffininbäddade vävnader. Det specifika protokollet i sådana fall är dock annorlunda eftersom de paraffininbäddade vävnaderna måste avvaxas21. Denna experimentella procedur kan tillämpas på plattor med 48 eller 96 brunnar, men plattor med 384 brunnar är …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från (1) Kinas nationella nyckelprogram för forskning och utveckling (2020YFE0201600); 2) National Nature Science Foundation (81973877 och 82174408). (3) Shanghai Collaborative Innovation Center för industriell omvandling av sjukhus-TCM-förberedelser; (4) Forskningsprojekt inom budget för Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |