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方法文章

外泌体负载胶原贴片联合非体外循环冠状动脉旁路移植术治疗慢性心肌缺血的猪外科模型

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DOI：

10.3791/65553

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2023年9月15日

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1Department of Surgery, University of Minnesota, 2School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen’s University Belfast, 3Cardiology, Richmond VA Medical Center, 4Department of Research Service, Center for Veterans Research and Education, Veterans Affairs Health Care System, 5Department of Neuroscience, University of Minnesota

本文内容

摘要

本研究介绍了一种由于进行性冠状动脉狭窄导致慢性心肌缺血的猪外科模型，该模型在无心肌梗死的情况下引起心脏功能受损。缺血发生后，动物接受非体外循环冠状动脉旁路移植术，并在心外膜放置富含干细胞来源外泌体的胶原贴片作为辅助治疗。该辅助疗法可改善心肌功能和恢复。

摘要

由进行性冠状动脉狭窄引起的慢性心肌缺血可导致心肌冬眠（HIB），即心肌通过降低代谢活动来适应供氧减少的状态，从而防止心肌细胞发生不可逆损伤和梗死。这与心肌梗死不同，因为HIB在血运重建后具有恢复的潜力。患有显著冠状动脉疾病（CAD）的患者会经历慢性缺血，使其面临心力衰竭和猝死的风险。目前治疗严重CAD的标准外科手术是冠状动脉旁路移植术（CABG），但研究表明该疗法并不完善，且尚无辅助疗法可用于恢复已适应慢性缺血的心肌细胞。为弥补这一空白，本研究采用了一种适用于CABG并能模拟临床情况的猪HIB外科模型。该模型包含两次手术：第一次手术是在左前降支（LAD）动脉上植入一个1.5 mm的刚性缩窄器；随着动物生长，缩窄器逐渐引起显著狭窄，导致局部收缩功能下降。当狭窄程度达到80%时，心肌血流和功能受损，从而形成HIB。随后使用左内乳动脉（LIMA）进行非体外循环CABG，以实现缺血区域的血运重建。术后动物恢复一个月，以在牺牲前获得最佳心肌功能改善，从而便于对不同治疗组进行生理学和组织学研究。该动物模型表明，即使经过CABG，心脏功能仍可能持续受损，提示需要开发新型辅助干预措施。在本研究中，开发了一种嵌有间充质干细胞（MSC）来源外泌体的胶原贴片，可在手术中将其应用于LIMA吻合口远端的心外膜表面。该材料可贴合心外膜，具有可吸收性，并为信号因子的持续释放提供支架。这种再生疗法可促进单纯血运重建无法奏效的心肌恢复。该模型为HIB恢复过程中的生理机制研究提供了临床转化途径。

引言

全球范围内，严重冠状动脉疾病（CAD）影响着超过一亿患者，尽管其死亡率已有所下降，但它仍然是导致死亡的主要原因之一1,2。CAD 的临床表现谱广泛，从心肌梗死（MI）到存在心肌存活性的缺血状态均属其范畴。大多数临床前研究集中于心肌梗死，因其特征为存在梗死组织，可在小型和大型动物模型中进行研究。然而，该模型无法涵盖那些心肌存活性保留且适合血运重建的患者。接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的大多数患者表现为血供减少和功能受限，同时在收缩储备和心肌存活性方面存在差异3。若不进行治疗，这些患者可能在负荷增加时进展为晚期心力衰竭甚至猝死4。在这些患者中，冠状动脉旁路移植术（CABG）是一种有效的治疗方法，但可能无法实现完全的功能恢复5。值得注意的是，舒张功能障碍是临床预后不良的标志，在血运重建后往往无法恢复，提示在 CABG 术中需要新的辅助治疗策略6,7。目前尚无可用于临床的、与 CABG 联用的辅助干预手段，以使心肌细胞恢复至完全功能状态。鉴于许多患者即使接受了适当的血运重建仍会进展为晚期心力衰竭，这一治疗空白尤为突出8

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方案

明尼阿波利斯退伍军人事务医疗中心和明尼苏达大学的机构动物照护与使用委员会（IACUC）已批准所有动物实验研究。实验遵循美国国家卫生研究院（NIH）现行的实验动物使用与照护指南。

1. 间充质干细胞的分离及外泌体的制备与表征

  1. 分离骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）
    1. 从一头20周龄雌性约克夏-长白猪的胸骨或胫骨获取30–50 mL无菌骨髓。操作时，将一根25 mm长的15G骨内针插入胸骨或胫骨，用含10 mL肝素的60 mL注射器抽取骨髓样本。
      注：有关骨髓采集的更多细节，请参见Pittenger等和Hocum-Stone等的研究12,16。
    2. 简而言之，将骨髓样本加入含肝素的Vacutainer CPT管中，在1800 x g条件下离心30分钟。
    3. 收集含有单个核细胞的白膜层，并用Hank's平衡盐溶液洗涤。通过离心沉淀单个核细胞，然后重悬于生长培养基（含10%胎牛血清[FBS]）中。
    4. 将单个核细胞转移至细胞培养瓶中进行贴壁培养。利用其贴壁特性，从单个核细胞组分中分离出MSCs。
    5. 在24小时内洗去所有非MSC细胞，仅在组织培养瓶中保留一层MSC单....

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结果

血运重建后，通过冠状动脉造影评估左前降支（LAD）狭窄程度（大于80%）以及左乳内动脉-左前降支（LIMA-LAD）桥血管的通畅性（图1）。血运重建手术及负载外泌体的胶原贴片植入后4周，进行心脏磁共振成像（MRI），通过以5 µg/kg/min速率输注低剂量多巴酚丁胺，评估静息和应激状态下的心脏收缩和舒张功能。收缩功能通过测定室壁增厚率（收缩末期室壁厚度－舒张末期室壁厚度）进行分析。舒张功能通过测定峰值充盈率与舒张末期容积的比值（PFR/EDV；图2）进行评估。进行延迟对比增强成像以确认LAD供血区域无心肌梗死。若LAD区域存在梗死，可能源于缩窄器导致血栓形成继而引起的动脉闭塞。局部室壁运动无异常表明不存在冬眠表型。

在低剂量多巴酚丁胺输注下，HIB动物组的舒张功能（以PFR/EDV衡量）较对照组显著下降（分别为5.5 ± 0.8与6.9 ± 1.5，p < 0.05）。CABG组相较于HIB组在PFR/EDV方面呈现改善趋势（分别为6.3 ± 0.9与5........

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讨论

本研究首次建立了慢性缺血性心肌的猪模型，结果表明，在外科血管重建术期间使用富含间充质干细胞来源外泌体的胶原贴片进行治疗，可通过靶向线粒体功能恢复，从而在正性肌力刺激下改善舒张期和收缩期功能。既往研究表明，在大型动物的心肌梗死后综合征（HIB）模型中，通过心脏磁共振成像（MRI）测量的舒张期和收缩期功能仍存在明显障碍，仅通过血管重建术可实现轻微改善，但无法完全恢复6,19。尽管左心室射血分数得以保留，心功能障碍依然存在。这些发现准确地模拟了临床上单支血管供血区域慢性缺血性心肌患者在左心室功能保留情况下的真实病程。

在再血管化手术过程中存在若干关键且技术性较强的挑战，尤其是在既往接受过开胸手术的情况下。由于心包此前已被打开且可能存在粘连，经胸骨入路时有发生心血管损伤的风险。胸骨切开术可能因心脏与胸骨位置邻近或存在粘连而造成心脏损伤。使用摆动锯可降低此类风险，研究表明该器械有助于实现顺利的胸骨再次进入。

成功实施冠状.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发局（BLR&D）的VA Merit Review基金#I01 BX000760（RFK）以及美国退伍军人事务部基金#I01 BX004146（TAB）的支持。我们还衷心感谢明尼苏达大学Lillehei心脏研究所提供的支持。本研究内容并不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 EthibondEthiconMG46G缝合线
# 40 剪毛刀头Oster078919-016-701清除手术部位毛发
0 VicrylEthiconJ208H缝合线
1 mL 注射器Medtronic/Covidien1188100777给药注射剂
1" 医用胶带MedlineMMM15271Z固定伤口敷料和静脉导管
1000mL 0.9% 氯化钠Baxter2B1324X静脉补液
12 mL 注射器Medtronic/Covidien8881512878给药注射剂
18 号针头BD305185注射剂给药
20 号针头BD305175注射剂给药
20 mL 注射器Medtronic/Covidien8881520657给药注射剂
2-0 VicrylEthiconJ317H缝合线
250 mL 0.9% 生理盐水Baxter UE1322D静脉补液
3 mL 注射器Medtronic/Covidien1180300555给药注射剂
3-0 VicrylEthiconVCP824G缝合线
36” 压力监测管路Smith’s MedicalMX563连接动脉导管 至传感器
4.0 mm 内径气管插管MedlineDYND43040建立冬眠状态下的气道
4-0 Tevdek II 缝线Deknatel7-922用于固定LAD周围缩窄器的缝线
48” 压力监测管路Smith’s MedicalMX564连接动脉导管 至传感器
500mL 0.9% 氯化钠Baxter2B1323Q药物输送，为吹雾器提供雾化液体
6  mL 注射器Medtronic/Covidien1180600777给药注射剂
6.0 mm 内径气管插管Mallinckrodt86049建立再灌注、MRI 和终止实验时的气道
6.5 mm 内径气管插管MedlineDYND43065建立再灌注、MRI 和终止实验时的气道
6” 压力管路Smith’s MedicalMX560采集骨髓
60 mL 注射器Medtronic/Covidien8881560125给药注射剂
7.0 mm 内径气管插管MedlineDYND43070建立再灌注、MRI 和终止实验时的气道
7-0 ProleneEthiconM8702缝合线
Advanced DMEM (1X)ThermoFisher Scientific12491023
酒精消毒棉片MedSourceMS-17402皮肤消毒剂
Amicon Ultra-15 离心过滤装置Millipore SigmaUFC910024
麻醉机DragerFabious Trio维持全身麻醉
麻醉机 + 呼吸机DRE Drager- Fabius TiroDRE0603FT向患者输送氧气和吸入麻醉剂
麻醉监护仪Phillips  IntellivueMP70多参数监护以保障患者安全
动脉导管套件ArrowASK-04510-HF股动脉导管用于血压监测
人工泪液Rugby0536-1086-91润滑眼睛，防止角膜干燥
Bair Hugger3MModel 505患者保温系统
基础手术包MedlineDYNJP1000无菌铺巾和手术台覆盖物
采血管-绿色盖帽Fisher Scientific02-689-7采集微球血样
吹雾器套件Medtronic/Covidien22120清除手术区域以利于血管吻合
BODIPY TR CeramideThermoFisher ScientificD7540
骨髓穿刺针- 25mm 15 号骨内针Vidacare9001-VC-005采集骨髓
骨蜡MedlineETHW31G骨断面止血
Bovie 电凝手柄CovidienE2516止血
布比卡因Pfizer00409-1161-01局部麻醉药
丁丙诺啡 0.3 mg/mLSigma AldrichB9275术前镇痛药，用于可存活手术
细胞刮刀Corning353085
头孢唑啉 1 gPfizer00409-0805-01抗生素
胸腔引流管Covidien8888561043排出胸腔内空气
氯己定-碘复合消毒液（Cloroprep）Becton Dickenson260815外科皮肤准备
CPT 管BD362753从骨髓中分离间充质干细胞（MSC）
Delrin 缩窄器明尼苏达大学（U of MN）定制造成左前降支（LAD）狭窄
DermabondEthiconDNX12皮肤粘合剂
DMEM (1X) 达尔伯克改良伊格尔培养基，含 HEPESThermoFisher Scientific12430062
多巴酚丁胺 12.5 mg/mLPfizer00409-2344-01在第二次微球血样采集期间升高血压和心率
心电图电极片DRE1496监测心律
外泌体去除胎牛血清（FBS）ThermoFisher ScientificA2720801
Falcon 一次性聚苯乙烯刻度移液管，无菌，10 mLFisher Scientific13-675-20
股动脉和颈动脉导引器Cordis- J&J504606P股动脉和颈动脉插管
胎牛血清，热灭活，Gibco FBSThermoFisher Scientific16140089
Flo-thru 1.0BaxterFT-12100用于LIMA与L的吻合
Flo-thru 1.25BaxterFT-12125FT-12125
Flo-thru 1.5BaxterFT-12150FT-12150
Flo-thru 2.0BaxterFT-12200FT-12200
GlutaMAX 补充剂ThermoFisher Scientific35050061
毛发剪刀Oster078566-011-002清除手术部位毛发
Helistat 胶原海绵McKesson570973 1690ZZ用于包埋外泌体的海绵
肝素Pfizer 0409-2720-03抗凝剂
组织学标本瓶Fisher Scientific316-154用于组织样本的福尔马林固定
HyClone 鉴定过的胎牛血清（FBS）CytivaSH30071.03
HypafixBSN Medical4210固定伤口敷料和静脉导管
异氟烷Sigma AldrichCDS019936全身麻醉吸入剂
吹雾器用静脉输液管Carefusion42493E连接至吹雾器的静脉输液装置
Jelco 18 号静脉导管Smiths medical4054用于再灌注、MRI 和终止实验时的静脉通路
利多卡因 2%Pfizer00409-4277-01局部麻醉药/抗心律失常药
LigaclipsEthiconMSC20LIMA 切断术用外科缝合钉
喉镜长刀片DRE12521便于观察气管以便插管
美洛昔康 5 mg/mLBoehringer Ingelheim141-219术后镇痛药
微球泵从股动脉导引器采集血样
单极电凝CovidienValleylab™ FT10止血
Nanosight NS 300Malvern PanalyticalMAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 软件Malvern PanalyticalMAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy IITerumo Cardiovascular System401-230心脏定位和稳定装置
氧气瓶 E 型气瓶多种多种若麻醉机无辅助流量计，则用于吹雾器
PBS，pH 7.2ThermoFisher Scientific20012050
青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合液ThermoFisher Scientific15640055
猪尾导管 145 型，6 法国Boston Scientific08641-41测量左心室压力
压力传感器多种必须适配麻醉监护仪监测直接动脉压
丙泊酚Diprivan269-29诱导麻醉药
罗库溴铵Mylan67457-228-05神经肌肉阻滞剂
缓释丁丙诺啡 10 mg/mLAbbott LabsNADA 141-434术后镇痛药
无菌生理盐水 20 mLFisher Scientific20T700220静脉导管冲洗液
胸骨锯/尸检锯Thermo Fisher812822用于打开胸腔
三通阀Smith MedicalMX5311L2 个用于连接猪尾导管
琥珀胆碱 20 mg/mLPfizer00409-6629-02神经肌肉阻滞剂
吸引 管路MedlineDYND50223
吸引容器MedlineDYNDCL03000
含胸腔牵开器的手术包多种参见包内清单股动脉切开和胸骨正中切开术
外科器械多种参见包内清单股动脉、颈动脉切开术及胸骨切开术
外科弹簧夹Applied MedicalA1801LIMA 切断后夹闭其末端
注射泵Harvard静脉输注多巴酚丁胺
SYTO RNASelect 绿色荧光细胞染料 - DMSO 中 5 mM 溶液Millipore SigmaS32703
Telazol 100 mg/mLFort Dodge01L60030术前镇静剂
Telpha 敷料Covidien2132无菌伤口敷料
计时器计时血样采集
总外泌体分离试剂（来自细胞培养上清）ThermoFisher Scientific4478359
TPP 细胞培养瓶，T75，带 0.22 µm PTFE 滤膜盖ThermoFisher ScientificTP90076
三重抗生素软膏Johnson & Johnson23734伤口表面外用
Vicryl 网状补片EthiconVKML用于心外膜细胞移植的补片
涡旋振荡器混匀微球
赛拉嗪 100 mg/mLVedco468RX术前镇静/镇痛药

参考文献

  1. Dai, H., et al. Global, regional, and burden of ischaemic heart disease and its attributable risk factors, 1990-2017: results from the Global Burden of Disease Study 2017. European heart journal. Quality of care & clinical outcomes. 8 (1), 50-60 (2022).
  2. Tsao, C. W., et al.

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