Gerichte uitschakeling van genen in de plexus choroideus
Summary
Hier beschrijven we een methode om selectief genexpressies in de plexus choroideus te veranderen en tegelijkertijd impact in andere hersengebieden te vermijden.
Abstract
De plexus choroideus (ChP) dient als een kritieke toegangspoort voor infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Recent onderzoek heeft aangetoond dat het reguleren van de ChP-activiteit bescherming kan bieden tegen aandoeningen van het CZS. Het bestuderen van de biologische functie van de ChP zonder andere hersengebieden te beïnvloeden is echter een uitdaging vanwege de delicate structuur. Deze studie presenteert een nieuwe methode voor gen-knockdown in ChP-weefsel met behulp van adeno-geassocieerde virussen (AAV’s) of cyclisatierecombinatie-enzym (Cre) recombinase-eiwit bestaande uit TAT-sequentie (CRE-TAT). De resultaten tonen aan dat na het injecteren van AAV of CRE-TAT in het laterale ventrikel, de fluorescentie uitsluitend geconcentreerd was in de ChP. Met behulp van deze aanpak schakelde de studie met succes de adenosine A 2A-receptor (A2A R) in de ChP uit met behulp van RNA-interferentie (RNAi) of Cre/locus van X-overP1 (Cre/LoxP) systemen, en toonde aan dat deze knockdown de pathologie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) zou kunnen verlichten. Deze techniek kan belangrijke implicaties hebben voor toekomstig onderzoek naar de rol van de ChP bij aandoeningen van het CZS.
Introduction
Van de plexus choroideus (ChP) werd vaak gedacht dat het hielp bij het handhaven van de functionele homeostase van de hersenen door cerebrospinale vloeistof (CSF) en brain-derived neurotrophic factor (BDNF) af te scheiden1,2. Toenemend onderzoek in de afgelopen drie decennia heeft aangetoond dat de ChP een duidelijke route vertegenwoordigt voor infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS).
De tight junctions (TJ’s) van de ChP, bestaande uit een monolaag ChP-epitheel, handhaven de immunologische homeostase door te voorkomen dat macromoleculen en immuuncellen de hersenen binnendringen3. Onder bepaalde pathologische omstandigheden detecteert en reageert het ChP-weefsel echter op gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP’s) in de CSF en het bloed, wat leidt tot abnormale immuuninfiltratie en hersendisfunctie 4,5. Ondanks zijn cruciale rol maken de kleine omvang en unieke locatie van de ChP in de hersenen het moeilijk om zijn functie te bestuderen zonder andere hersengebieden te beïnvloeden. Daarom is het manipuleren van genexpressie specifiek in de ChP een ideale benadering om de functie ervan te begrijpen.
Aanvankelijk werden transgene lijnen van cyclisatierecombinatie-enzym (Cre), die Cre tot expressie brengen onder controle van promotoren die specifiek zijn voor genen die tot expressie worden gebracht in de ChP, vaak gebruikt om doelgenen te verwijderen door te fokken met gefloxte kandidaatgenen 6,7,8. De transcriptiefactor Forkhead box J1 (FoxJ1) wordt bijvoorbeeld uitsluitend tot expressie gebracht in het ChP-epitheel van de prenatale muizenhersenen7. Zo werd de FoxJ1-Cre-lijn vaak gebruikt om genen in de ChP 6,9 te verwijderen. Het succes van deze strategie hangt echter sterk af van de specificiteit van de promotor. Geleidelijk aan werd ontdekt dat het expressiepatroon van FoxJ1 niet onderscheidend genoeg was, aangezien FoxJ1 ook aanwezig was in trilhaarepitheelcellen in andere delen van de hersenen en hetperifere systeem. Om deze beperking te overwinnen, werd intra-cerebroventriculaire (ICV) injectie van Cre-recombinase uitgevoerd om recombinase af te leveren in de ventrikels van gefloxte transgene lijnen. Deze strategie vertoonde een hoge specificiteit, zoals blijkt uit de aanwezigheid van tdTomato-fluorescentie uitsluitend in het ChP-weefsel10,11. Deze methode wordt echter nog steeds beperkt door de beschikbaarheid van gefloxte transgene muislijnen. Om dit probleem aan te pakken, hebben onderzoekers ICV-injectie van adeno-geassocieerd virus (AAV) gebruikt om ChP-specifieke knockdown of de overexpressie van doelgenen te bereiken12,13. Een uitgebreide evaluatie van verschillende AAV-serotypen voor ChP-infectie onthulde dat AAV2/5 en AAV2/8 sterke infectiemogelijkheden vertonen in de ChP, terwijl ze geen andere hersengebieden infecteren. AAV2/8 bleek echter het ependyma rond ventrikels te infecteren, terwijl de AAV2/5-groep geen infectie vertoonde14. Deze methode heeft het voordeel dat de beperkingen van het verwerven van transgene dieren met floxs worden overwonnen.
Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol voor gen-knockdown in de ChP met behulp van twee methoden: ICV van AAV2/5 met shRNA van de adenosine A 2A-receptor (A 2A R) en Cre-recombinase-eiwit bestaande uit TAT-sequentie (CRE-TAT) recombinase om ChP-specifieke knockdown van A2A Rte bereiken. De bevindingen van de studie suggereren dat het uitschakelen van A2AR in de ChP experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) kan verlichten. Dit gedetailleerde protocol biedt nuttige richtlijnen voor ChP-functiestudies en de specifieke knockdown van genen in de ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het onderzoek presenteerde twee verschillende benaderingen voor de gerichte knockdown van ChP-genen. De eerste benadering betrof de ICV-injectie van CRE-TAT, dat Cre-recombinase bevat, in A2AR flox/flox-muizen. De tweede benadering omvatte ICV-injectie van AAV2/5 met shRNA van A2AR. Door gebruik te maken van deze twee strategieën bereikte het werk de selectieve knockdown van A 2A R binnen de ChP en was het in staat om de beschermende effecten aan te tonen van het remmen van A2A</sub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de steun van de National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 31800903, toegekend aan W. Zheng) en het Wenzhou Science and Technology Project (nr. Y2020426, toegekend aan Y. Y. Weng) voor dit werk.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
