Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode, um die Genexpression im Plexus choroideus selektiv zu verändern und gleichzeitig Auswirkungen auf andere Hirnareale zu vermeiden.
Abstract
Der Plexus choroideus (ChP) dient sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritisches Einfallstor für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS). Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Regulierung der ChP-Aktivität Schutz vor ZNS-Erkrankungen bieten kann. Die biologische Funktion des ChP zu untersuchen, ohne andere Hirnregionen zu beeinträchtigen, ist jedoch aufgrund seiner empfindlichen Struktur eine Herausforderung. In dieser Arbeit wird eine neue Methode zum Gen-Knockdown in ChP-Gewebe unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs) oder Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre)-Rekombinase-Proteinen, bestehend aus TAT-Sequenzen (CRE-TAT), vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der Injektion von AAV oder CRE-TAT in den lateralen Ventrikel die Fluoreszenz ausschließlich im ChP konzentriert war. Mit diesem Ansatz gelang es in der Studie, den Adenosin-A2A-Rezeptor (A2A R) im ChP mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) oder Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP)-Systemen auszuschalten, und zeigte, dass dieser Knockdown die Pathologie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) lindern könnte. Diese Technik könnte wichtige Implikationen für die zukünftige Forschung über die Rolle des ChP bei ZNS-Erkrankungen haben.
Introduction
Es wurde oft angenommen, dass der Plexus choroideus (ChP) zur Aufrechterhaltung der funktionellen Homöostase des Gehirns beiträgt, indem er Liquor cerebrospinalis (CSF) und den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) sezerniert1,2. Zunehmende Forschung in den letzten drei Jahrzehnten hat gezeigt, dass das ChP einen eindeutigen Weg für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) darstellt.
Die Tight Junctions (TJs) des ChP, die aus einem monoschichtigen ChP-Epithel bestehen, halten die immunologische Homöostase aufrecht, indem sie verhindern, dass Makromoleküle und Immunzellen in das Gehirn eindringen3. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen erkennt und reagiert das ChP-Gewebe jedoch auf gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) im Liquor und im Blut, was zu einer abnormalen Immuninfiltration und einer Dysfunktion des Gehirns führt 4,5. Trotz seiner entscheidenden Rolle machen es die geringe Größe und die einzigartige Lage des ChP im Gehirn schwierig, seine Funktion zu untersuchen, ohne andere Gehirnregionen zu beeinträchtigen. Daher ist die spezifische Manipulation der Genexpression im ChP ein idealer Ansatz, um seine Funktion zu verstehen.
Ursprünglich wurden transgene Linien von Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre), die Cre unter der Kontrolle von Promotoren exprimieren, die für Gene spezifisch sind, die in der ChP exprimiert werden, verwendet, um Zielgene durch Züchtung mit floxierten Kandidatengenen zu löschen 6,7,8. Zum Beispiel wird der Transkriptionsfaktor Forkhead box J1 (FoxJ1) ausschließlich im ChP-Epithel des pränatalen Mäusegehirns exprimiert7. So wurde die FoxJ1-Cre-Linie häufig verwendet, um Gene zu löschen, die sich im ChP 6,9 befinden. Der Erfolg dieser Strategie hängt jedoch stark von der Spezifität des Projektträgers ab. Nach und nach wurde entdeckt, dass das FoxJ1-Expressionsmuster nicht ausgeprägt genug war, da FoxJ1 auch in Flimmerepithelzellen in anderen Teilen des Gehirns und des peripheren Systems vorhanden war7. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von Cre-Rekombinase durchgeführt, um Rekombinase in die Ventrikel von gefloxten transgenen Linien zu bringen. Diese Strategie zeigte eine hohe Spezifität, was durch das Vorhandensein von tdTomato-Fluoreszenz allein im ChP-Gewebe belegtwird 10,11. Diese Methode ist jedoch noch durch die Verfügbarkeit von floxierten transgenen Mauslinien begrenzt. Um dieses Problem anzugehen, haben Forscher die ICV-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) eingesetzt, um einen ChP-spezifischen Knockdown oder die Überexpression von Zielgenen zu erreichen12,13. Eine umfassende Untersuchung verschiedener AAV-Serotypen für eine ChP-Infektion ergab, dass AAV2/5 und AAV2/8 starke Infektionsfähigkeiten in der ChP aufweisen, während sie andere Hirnregionen nicht infizieren. Es wurde jedoch festgestellt, dass AAV2/8 das Ependym um die Ventrikel herum infizierte, während die AAV2/5-Gruppe keine Infektion aufwies14. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie die Einschränkungen beim Erwerb von transgenen Tieren überwindet.
Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Gen-Knockdown im ChP mit zwei Methoden: ICV von AAV2/5, das shRNA des Adenosin-A2A-Rezeptors (A 2A R) trägt, und Cre-Rekombinase-Protein, das aus einer TAT-Sequenz (CRE-TAT)-Rekombinase besteht, um einen ChP-spezifischen Knockdown von A2A R zu erreichen. Die Studienergebnisse deuten darauf hin, dass der Abbau von A2AR in der ChP die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) lindern kann. Dieses detaillierte Protokoll bietet nützliche Hinweise für ChP-Funktionsstudien und den spezifischen Knockdown von Genen im ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Studie wurden zwei unterschiedliche Ansätze für den gezielten Knockdown von ChP-Genen vorgestellt. Der erste Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von CRE-TAT, das Cre-Rekombinase enthält, in A2AR-Flox/Flox-Mäuse. Der zweite Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von AAV2/5, das shRNA von A2AR trägt. Durch die Verwendung dieser beiden Strategien gelang es der selektiven Knockdown von A 2A R innerhalb der ChP und konnte die schützende Wirkung der Hemmung des A2AR-Signa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 31800903, vergeben an W. Zheng) und dem Wenzhou Science and Technology Project (Nr. Y2020426, vergeben an Y. Y. Weng) für diese Arbeit.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
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