Направленный нокдаун генов в сосудистом сплетении
Summary
В этой статье мы опишем метод избирательного изменения экспрессии генов в сосудистом сплетении, избегая при этом какого-либо воздействия на другие области мозга.
Abstract
Сосудистое сплетение (ЧП) служит важнейшими воротами для инфильтрации иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС) как при физиологических, так и при патологических состояниях. Недавние исследования показали, что регуляция активности ChP может обеспечить защиту от заболеваний ЦНС. Тем не менее, изучение биологической функции ChP, не затрагивая другие области мозга, является сложной задачей из-за его тонкой структуры. В этом исследовании представлен новый метод нокдауна генов в тканях ChP с использованием аденоассоциированных вирусов (AAV) или белка рекомбиназы фермента циклизации (Cre), состоящего из последовательности TAT (CRE-TAT). Результаты показывают, что после введения AAV или CRE-TAT в боковой желудочек флуоресценция концентрировалась исключительно в ChP. Используя этот подход, исследование успешно сбило рецептор аденозинаА2А (A2AR) в ChP с помощью РНК-интерференции (РНК-интерференции) или Cre/локуса систем X-overP1 (Cre/LoxP) и показало, что этот нокдаун может облегчить патологию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Этот метод может иметь важное значение для будущих исследований роли ChP в заболеваниях ЦНС.
Introduction
Часто считалось, что сосудистое сплетение помогает поддерживать функциональный гомеостаз мозга за счет секреции спинномозговой жидкости (ликвора) и нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)1,2. Растущее количество исследований за последние три десятилетия показало, что ChP представляет собой особый путь инфильтрации иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС).
Плотные соединения (ТЖ) ChP, состоящие из монослойного эпителия ChP, поддерживают иммунологический гомеостаз, предотвращая проникновение макромолекул и иммунных клеток в мозг3. Однако при определенных патологических состояниях ткань ChP обнаруживает и реагирует на опасные молекулярные паттерны (DAMPs) в ликворе и крови, что приводит к аномальной иммунной инфильтрации и дисфункции мозга 4,5. Несмотря на его важнейшую роль, небольшой размер ChP и уникальное расположение в мозге затрудняют изучение его функции, не затрагивая другие области мозга. Таким образом, манипулирование экспрессией генов именно в ChP является идеальным подходом к пониманию его функции.
Первоначально трансгенные линии фермента циклизационной рекомбинации (Cre), экспрессирующие Cre под контролем промоторов, специфичных для генов, экспрессируемых в ChP, обычно использовались для удаления генов-мишеней путем скрещивания с флоксированными генами-кандидатами 6,7,8. Например, транскрипционный фактор Forkhead box J1 (FoxJ1) экспрессируется исключительно в эпителии ChP пренатального мозга мыши7. Так, линия FoxJ1-Cre часто использовалась для удаления генов, расположенных в ChP 6,9. Однако успех этой стратегии в значительной степени зависит от специфики промоутера. Постепенно было обнаружено, что паттерн экспрессии FoxJ1 был недостаточно отчетливым, поскольку FoxJ1 также присутствовал в реснитчатых эпителиальных клетках в других частях мозга и периферической системы7. Для преодоления этого ограничения была проведена интрацеребровентрикулярная (ИКВ) инъекция Cre-рекомбиназы для доставки рекомбиназы в желудочки флоксированных трансгенных линий. Данная стратегия показала высокую специфичность, о чем свидетельствует наличие флуоресценции tdTomato исключительно в ткани ChP10,11. Однако этот метод все еще ограничен наличием флоксированных трансгенных линий мышей. Чтобы решить эту проблему, исследователи использовали ICV-инъекцию аденоассоциированного вируса (AAV) для достижения ChP-специфического нокдауна или гиперэкспрессии генов-мишеней12,13. Комплексная оценка различных серотипов AAV на ChP-инфекцию показала, что AAV2/5 и AAV2/8 проявляют сильные инфекционные способности в ChP, не инфицируя при этом другие области мозга. Тем не менее, было обнаружено, что AAV2/8 инфицирует окружающие эпендиму желудочки, в то время как группа AAV2/5 не показала инфекции14. Преимущество этого метода заключается в преодолении ограничений, связанных с приобретением флоксированных трансгенных животных.
В данной статье описан пошаговый протокол нокдауна гена в ChP с использованием двух методов: ICV AAV2/5, несущей шРНК рецептора аденозина А2А (А2А R) и белкаCre-рекомбиназы, состоящего из последовательности ТАТ (CRE-TAT) рекомбиназы для достижения ChP-специфического нокдауна A2AR. Результаты исследования свидетельствуют о том, что сбивание A2AR в ChP может облегчить экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ). Этот подробный протокол содержит полезные рекомендации для изучения функции ChP и специфического нокдауна генов в ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
В исследовании были представлены два различных подхода к направленному нокдауну генов ChP. Первый подход включал в себя ICV-инъекцию CRE-TAT, содержащей Cre-рекомбиназу, мышам линии A2AR flox/flox . Второй подход заключался в введении ICV AAV2/5, несущей шРНКA2AR. Используяэти две ст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность за поддержку этой работы Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 31800903, присужден В. Чжэну) и Вэньчжоускому научно-техническому проекту (No Y2020426, присужден Ю. Ю. Вэну).
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
