Burada, diğer beyin bölgelerinde herhangi bir etkiden kaçınırken koroid pleksustaki gen ekspresyonlarını seçici olarak değiştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Koroid pleksus (ChP), hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında merkezi sinir sistemine (MSS) immün hücre infiltrasyonu için kritik bir geçit görevi görür. Son araştırmalar, ChP aktivitesinin düzenlenmesinin CNS bozukluklarına karşı koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerini etkilemeden ChP’nin biyolojik işlevini incelemek, hassas yapısı nedeniyle zordur. Bu çalışma, adeno-ilişkili virüsler (AAV’ler) veya TAT dizisinden (CRE-TAT) oluşan siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) rekombinaz proteini kullanılarak ChP dokusunda gen yıkımı için yeni bir yöntem sunmaktadır. Sonuçlar, lateral ventriküle AAV veya CRE-TAT enjekte edildikten sonra, floresansın sadece ChP’de yoğunlaştığını göstermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, çalışma, RNA interferansı (RNAi) veya X-overP1 (Cre / LoxP) sistemlerinin Cre / lokusu kullanılarak ChP’deki adenozin A2A reseptörünü (A2AR) başarılı bir şekilde yıktı ve bu yıkımın deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) patolojisini hafifletebileceğini gösterdi. Bu teknik, ChP’nin CNS bozukluklarındaki rolü üzerine gelecekteki araştırmalar için önemli etkilere sahip olabilir.
Koroid pleksusun (ChP) genellikle beyin omurilik sıvısı (BOS) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) salgılayarak beyin fonksiyonel homeostazının korunmasına yardımcı olduğu düşünülüyordu1,2. Son otuz yılda artan araştırmalar, CHP’nin merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu için farklı bir yolu temsil ettiğini ortaya koymuştur.
Tek katmanlı bir ChP epitelinden oluşan ChP’nin sıkı bağlantıları (TJ’ler), makromoleküllerin ve bağışıklık hücrelerinin beyne girmesini önleyerek immünolojik homeostazı korur3. Bununla birlikte, belirli patolojik koşullar altında, ChP dokusu, BOS ve kandaki tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP’ler) algılar ve bunlara yanıt verir, bu da anormal bağışıklık infiltrasyonuna ve beyin işlev bozukluğunayol açar 4,5. Kritik rolüne rağmen, ChP’nin küçük boyutu ve beyindeki benzersiz konumu, diğer beyin bölgelerini etkilemeden işlevini incelemeyi zorlaştırır. Bu nedenle, özellikle ChP’de gen ekspresyonunu manipüle etmek, işlevini anlamak için ideal bir yaklaşımdır.
Başlangıçta, ChP’de eksprese edilen genlere özgü promotörlerin kontrolü altında Cre’yi eksprese eden siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) transgenik hatları, floklanmış aday genlerleüreme yoluyla hedef genleri silmek için yaygın olarak kullanıldı 6,7,8. Örneğin, transkripsiyon faktörü Forkhead kutusu J1 (FoxJ1), yalnızca doğum öncesi fare beyninin7 ChP epitelinde eksprese edilir. Bu nedenle, FoxJ1-Cre çizgisi genellikle ChP 6,9’da bulunan genleri silmek için kullanıldı. Bununla birlikte, bu stratejinin başarısı büyük ölçüde destekleyicinin özgüllüğüne bağlıdır. FoxJ1’in beynin diğer bölümlerindeki ve periferik sistemdeki kirpikli epitel hücrelerinde de mevcut olması nedeniyle, FoxJ1 ekspresyon modelinin yeterince ayırt edici olmadığı yavaş yavaş keşfedildi7. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, floklanmış transgenik hatların ventriküllerine rekombinaz vermek için intraserebroventriküler (ICV) Cre rekombinaz enjeksiyonu yapıldı. Bu strateji, yalnızca ChP dokusunda tdTomato floresansının varlığı ile kanıtlandığı gibi yüksek özgüllük göstermiştir10,11. Bununla birlikte, bu yöntem hala floklanmış transgenik fare hatlarının mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bu sorunu çözmek için araştırmacılar, ChP’ye özgü yıkımı veya hedef genlerin aşırı ekspresyonunu elde etmek için adeno-ilişkili virüsün (AAV) ICV enjeksiyonunu kullandılar12,13. ChP enfeksiyonu için farklı AAV serotiplerinin kapsamlı bir değerlendirmesi, AAV2/5 ve AAV2/8’in diğer beyin bölgelerini enfekte etmemekle birlikte CHP’de güçlü enfeksiyon yetenekleri sergilediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, AAV2/8’in ventrikülleri çevreleyen ependimayı enfekte ettiği bulunurken, AAV2/5 grubunda enfeksiyon görülmedi14. Bu yöntem, floklanmış transgenik hayvanları edinme sınırlamalarının üstesinden gelme avantajına sahiptir.
Bu makale, iki yöntem kullanarak ChP’de gen yıkımı için adım adım bir protokolü açıklamaktadır: adenozin A2A reseptörünün (A 2A R) shRNA’sını taşıyan AAV2/5’in ICV’si ve A2AR’nin ChP’ye özgü yıkımını elde etmek için TAT dizisi (CRE-TAT) rekombinazından oluşan Cre rekombinaz proteini. Çalışma bulguları, CHP’de A2AR’nin yıkılmasının deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) hafifletebileceğini düşündürmektedir. Bu ayrıntılı protokol, ChP fonksiyon çalışmaları ve ChP’deki genlerin spesifik yıkımı için yararlı rehberlik sağlar.
Araştırma, ChP genlerinin hedeflenen yıkımı için iki farklı yaklaşım sundu. İlk yaklaşım, Cre rekombinaz içeren CRE-TAT’ın A2AR flox/flox farelerine ICV enjeksiyonunu içeriyordu. İkinci yaklaşım, A2AR’nin shRNA’sını taşıyan AAV2/5’in ICV enjeksiyonunu gerektiriyordu. Bu iki stratejiyi kullanarak, çalışma ChP içinde A 2A R’nin seçici olarak yıkılmasını sağladı ve ChP’de A2AR sinyalini inhibe etmenin EAE patolojisi üzerindeki koruyucue…
The authors have nothing to disclose.
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (31800903 No’lu Hibe, W. Zheng’e verildi) ve Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi’nin (No. Y2020426, Y. Y. Weng’e verildi) bu çalışma için desteğini minnetle kabul ediyoruz.
A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
DAPI | Absin | B25A031 | |
frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
OCT glue | Epredia | 6502p | |
paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |