Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen (AdMSCs) haben starke immunmodulatorische Eigenschaften, die bei der Behandlung von Krankheiten, die mit Entzündungen verbunden sind, nützlich sind. Wir zeigen, wie murine AdMSCs und primäre gemischte Gliazellen isoliert und kultiviert, AdMSCs zur Hochregulierung entzündungshemmender Gene und Wachstumsfaktoren stimuliert, die Migration von AdMSCs bewertet und AdMSCs mit primär gemischten Prionen-infizierten Gliazellen co-kultiviert werden.
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Methodenartikel
Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind durch die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren starke Regulatoren von Entzündungen. Diese Zellen zeigen die Fähigkeit, Neuroinflammation im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wie der Prionenkrankheit und anderen Proteinfehlfaltungsstörungen zu regulieren. Prionenkrankheiten können sporadisch, erworben oder genetisch bedingt sein; Sie können aus der Fehlfaltung und Aggregation des Prionproteins im Gehirn resultieren. Diese Krankheiten verlaufen ausnahmslos tödlich, und es gibt keine Behandlungsmöglichkeiten.
Eines der frühesten Anzeichen einer Krankheit ist die Aktivierung von Astrozyten und Mikroglia und die damit verbundene Entzündung, die vor der nachweisbaren Prionenaggregation und dem neuronalen Verlust auftritt. So können die entzündungshemmenden und regulatorischen Eigenschaften von MSCs zur Behandlung von Astrogliose bei Prionenkrankheit genutzt werden. Kürzlich haben wir gezeigt, dass aus Fett gewonnene MSCs (AdMSCs), die mit BV2-Zellen oder primären gemischten Gliazellen kokultiviert werden, Prionen-induzierte Entzündungen durch parakrine Signalwege reduzieren. In dieser Arbeit wird eine zuverlässige Behandlung mit stimulierten AdMSCs beschrieben, um die Prionen-induzierte Entzündung zu verringern.
Eine heterozygote Population von AdMSCs kann leicht aus murinem Fettgewebe isoliert und in Kultur expandiert werden. Die Stimulation dieser Zellen mit inflammatorischen Zytokinen verbessert ihre Fähigkeit, sowohl in Richtung Prionen-infiziertes Gehirnhomogenat zu wandern als auch als Reaktion darauf entzündungshemmende Modulatoren zu produzieren. Zusammen können diese Techniken verwendet werden, um das therapeutische Potenzial von MSCs bei Prioneninfektionen zu untersuchen und können für andere Proteinfehlfaltungen und neuroinflammatorische Erkrankungen angepasst werden.
Einleitung
Gliaentzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen, darunter Parkinson, Alzheimer und Prionen. Obwohl die abnormale Proteinaggregation auf einen Großteil der Krankheitspathogenese und Neurodegeneration zurückgeführt wird, spielen Gliazellen auch eine Rolle bei der Verschlimmerung dieser Situation 1,2,3. Daher ist die gezielte Behandlung von glialinduzierten Entzündungen ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Bei der Prionenerkrankung faltet sich das zelluläre Prionprotein (PrPC) falsch zum krankheitsassoziier....
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Protokoll
Die Mäuse wurden bei den Labortierressourcen des Bundesstaates Colorado gezüchtet und gepflegt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International akkreditiert sind, in Übereinstimmung mit dem Protokoll #1138, das vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Colorado State University genehmigt wurde.
1. Isolierung und Infektion primärer kortikaler gemischter Gliazellen mit Prionen
- Um primäre gemischte Gliazellen zu isolieren, die sowohl Astrozyten als auch Mikroglia enthalten, erhalten Sie C57Bl/6-Mauswelpen im Alter von null bis zwei Tagen.
HINWEIS: Dieses Proto....
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Ergebnisse
Die Stimulation von AdMSCs mit TNFα oder Interferon-gamma (IFNγ) für 24 Stunden führt zu Veränderungen in der Expression von entzündungshemmenden Molekülen und Wachstumsfaktoren. Die Behandlung von AdMSCs mit TNFα oder Interferon-gamma (IFNγ) erhöht die mRNA des TNF-stimulierten Gens 6 (TSG-6), während TNFα, aber nicht IFNγ, einen Anstieg der mRNA des transformierenden Wachstumsfaktors beta-1 (TGFβ-1) verursacht. Die Stimulation mit TNFα oder IFNγ induziert einen Anstieg der mRNA des vaskulären endothel.......
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Diskussion
In dieser Arbeit demonstrieren wir ein zuverlässiges und relativ kostengünstiges Protokoll zur Bewertung der Auswirkungen von aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stromazellen (AdMSCs) auf die Verringerung der Prionen-induzierten Entzündung in einem Gliazellmodell. AdMSCs können leicht isoliert und in Kultur für den Einsatz in nur 1 Woche erweitert werden. Dieses Protokoll erzeugt konsistent eine heterologe Population von Zellen, die durch Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie Marker exprimieren, die mit denen von mesen.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Die Autoren danken Lab Animal Resources für die Tierhaltung. Zu unseren Finanzierungsquellen für dieses Manuskript gehören der Boettcher Fund, der Murphy Turner Fund, das CSU College of Veterinary Medicine und der Biomedical Sciences College Research Council. Abbildung 2A, Abbildung 2C und Abbildung 3A wurden mit BioRender.com erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 ml serologische Pipetten | Celltreat | 229005B | |
| 6-Well-Gewebekulturplatten | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm Zellkulturschalen | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serologische Pipetten | Celltreat | 229210 | |
| konische 15-ml-Röhrchen | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL konische Röhrchen | Celltreat | 667050B | |
| BV2 Mikroglia-Zelllinie | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Zelllifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Kristallviolett | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essentielle Aminosäuren | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fötales Rinderserum (Hitze inaktiviert) | Peak Serum | PS-FB4 | Kann als hitzeinaktivierte oder im Labor inaktivierte Form |
| erworben werden Formaldehyd | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glas 10 mL serologische Pipette | Corning | 7077-10N | |
| Hank' s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hämozytometer/Neubauer Kammer | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| Low Glucose DMEM mit L-Glutamin | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024. | |
| nicht-essentielle Aminosäuren | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyd (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | Cytiva | SH30256.01 | |
| Rekombinante Maus IFN-gamma Protein | F& D Systems | 485-MI | |
| Rekombinantes Maus-TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | F& D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Innenseite von Glaspipetten durch zweimaliges Auf- und Absaugen in Sigmacote beschichten und gründlich trocknen lassen. In Alufolie einwickeln und 24 Stunden später autoklavieren. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Kollagenase/Dispase-Gemisch |
| Steriles, einzeln verpacktes Wattestäbchen | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Gewebekultur-Einsätze, 24 Well, Porengröße=8 & Mikro; m | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Gewebekultur-Einsätze, 6 Well, Porengröße=0,4 µ m | Greiner Bio-One | 657641 |
Referenzen
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state t....
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Nachdrucke und Genehmigungen
