Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien
Summary
Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.
Abstract
Es wurden mehrere Modelle entwickelt, um die Angiogenese in vivo zu untersuchen. Die meisten dieser Modelle sind jedoch komplex und teuer, erfordern spezielle Geräte oder sind für die anschließende quantitative Analyse schwer durchzuführen. Hier präsentieren wir einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay zur Bewertung der Angiogenese in vivo. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken der Empfängermäuse injiziert. Nach 7 Tagen wird Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die Dextran-FITC enthält, über die Schwanzvene injiziert und 30 Minuten lang in den Gefäßen zirkuliert. Matrix-Gel-Plugs werden gesammelt und mit Gewebeeinbettungsgel eingebettet, dann werden 12-μm-Abschnitte für die Fluoreszenzdetektion ohne Färbung geschnitten. In diesem Assay kann Dextran-FITC mit hohem Molekulargewicht (~150.000 Da) verwendet werden, um funktionelle Gefäße zum Nachweis ihrer Länge anzuzeigen, während Dextran-FITC mit niedrigem Molekulargewicht (~4.400 Da) verwendet werden kann, um die Permeabilität von Neogefäßen anzuzeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine zuverlässige und bequeme Methode für die quantitative Untersuchung der Angiogenese in vivo bieten kann.
Introduction
Die Angiogenese, der Prozess der Bildung von Neogefäßen aus bereits bestehenden Gefäßen, spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Embryonalentwicklung, Wundheilung, Arteriosklerose, Tumorentwicklung usw.1,2,3,4,5. Dieser dynamische Prozess umfasst mehrere Schritte, darunter den Abbau der Matrix, die Proliferation von Gefäßzellen, die Migration und Selbstorganisation zu röhrenförmigen Strukturen sowie die Stabilisierung der Neogefäße6. Die Förderung der Angiogenese hat sich bei der Behandlung von Myokardinfarkt, Schlaganfall und anderen Arten von ischämischen Erkrankungen als entscheidend erwiesen7, während die Hemmung der Angiogenese als vielversprechende Strategie bei der Behandlung von Krebs8 und rheumatoiden Erkrankungen9 angesehen wurde. Die Angiogenese wurde als Organisationsprinzip für die Arzneimittelforschung angesehen10. Daher ist die Konstruktion einer zuverlässigen und bequemen Methode zur Beurteilung des Ausmaßes der Angiogenese für die mechanische Forschung oder die Arzneimittelforschung bei Angiogenese-abhängigen Erkrankungen von entscheidender Bedeutung.
Es wurden mehrere In-vitro– und In-vivo-Modelle entwickelt, um die Angiogenesezu bewerten 11. Unter diesen können zweidimensionale (2-D) Modelle, wie der Matrix-Gel-Röhrchenbildungsassay12, keine funktionellen röhrenförmigen Strukturen bilden. Die Tiermodelle, wie z. B. das Ischämie-Modellder Hintergliedmaßen 13,14, können den Angiogeneseprozess reproduzieren, sind jedoch komplex und erfordern ein Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem. 3D-Modelle der vaskulären Morphogenese, wie der Matrix-Gel-Plug-Assay, bieten eine einfache Plattform, die den Prozess der Angiogenese in vivo nachahmen kann 15, aber der Nachweis der Angiogenese erfordert Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung 16,17,18, die variabel und schlecht visualisiert sind.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay, bei dem Gefäßzellen mit Matrixgel gemischt und subkutan in den Rücken von Mäusen injiziert wurden, um einen Plug zu bilden. Im Pfropfen müssen Gefäßzellen die Matrix abbauen, sich vermehren, migrieren und sich selbst organisieren, um schließlich funktionsfähige Gefäße mit Blutfluss in der inneren Umgebung zu bilden. Danach wird fluoreszenzmarkiertes Dextran über die Schwanzvene injiziert, um durch den Pfropfen zu fließen, und die Markierung wird visualisiert, um Neogefäße anzuzeigen. Der Gehalt an Angiogenese kann quantitativ anhand der Länge der Gefäße bewertet werden. Diese Methode kann funktionelle Gefäße bilden, die in 2-D-Angiogenesemodellen12 nicht hergestellt werden können, und erfordert keinen komplexen Färbeprozess wie bei gewöhnlichem Matrix-Gel-Plug-Assay11. Es erfordert auch keine teuren spezifischen Instrumente wie das Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem bei der Ischämie der HintergliedmaßenModell 13,14,19. Diese Methode ist vielseitig, kostengünstig, quantifizierbar und einfach durchzuführen und kann zur Bestimmung der pro- oder antiangiogenen Fähigkeit von Arzneimitteln oder in der mechanischen Forschung zur Angiogenese verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren eine zuverlässige und komfortable Methode zur quantitativen Bewertung der Angiogenese in vivo ohne Färbung. In diesem Protokoll wurden Gefäßzellen in Gegenwart von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Reagenzien mit Matrixgel gemischt und dann subkutan in den Rücken von Nu/Nu-Mäusen injiziert, um einen Gelpfropfen zu bilden (Abbildung 1). Nach 7 Tagen Gelpfropfenbildung wurde Dextran-FITC intravenös injiziert und 30 Minuten lang zirkuliert. Der Gelpfropfen wu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY22H020005) und der National Natural Science Foundation of China (81873466) finanziert.
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
