혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay
Summary
여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.
Abstract
생체 내 혈관 신생을 조사하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. 그러나 이러한 모델의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 들거나 특수 장비가 필요하거나 후속 정량 분석을 위해 수행하기 어렵습니다. 여기서는 생체 내 혈관신생을 평가하기 위해 수정된 매트릭스 겔 플러그 분석을 제시합니다. 이 프로토콜에서, 혈관 세포를 pro-angiogenic 또는 anti-angiogenic 시약의 존재 또는 부재 하에서 매트릭스 겔과 혼합한 후, 수용 마우스의 등에 피하 주사하였다. 7일 후, 덱스트란-FITC를 함유한 인산염 완충 식염수를 꼬리정맥을 통해 주입하여 30분 동안 혈관 내에서 순환시킵니다. 매트릭스 겔 플러그를 채취하여 조직 포매 겔로 포매한 다음 염색 없이 형광 검출을 위해 12μm 절편을 절단합니다. 이 분석에서 고분자량(~150,000Da)의 dextran-FITC는 길이를 검출하기 위한 기능성 용기를 나타내는 데 사용할 수 있으며, 저분자량(~4,400Da)의 dextran-FITC는 신생 혈관의 투과성을 나타내는 데 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 생체 내 혈관신생의 정량적 연구를 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법을 제공할 수 있습니다.
Introduction
기존 혈관에서 신생 혈관을 형성하는 과정인 혈관신생은 배아 발달, 상처 치유, 죽상동맥경화증, 종양 발달 등과 같은 많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.1,2,3,4,5. 이 역동적인 과정에는 매트릭스의 분해, 혈관 세포 증식, 관 구조를 형성하기 위한 이동 및 자기 조직화, 신생 혈관의 안정화6 등 여러 단계가 포함된다. 혈관신생을 촉진하는 것은 심근경색, 뇌졸중 및 기타 허혈성 질환7의 치료에 중요한 것으로 입증되었으며, 혈관신생을 억제하는 것은 암8 및 류마티스 질환9의 치료에 있어 유망한 전략으로 간주되어 왔다. 혈관신생은 신약 개발의 조직 원리로 간주되어 왔다10. 따라서, 혈관신생의 정도를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법의 구축은 혈관신생 의존성 질환의 기계적 연구 또는 약물 발견에 매우 중요합니다.
혈관신생을 평가하기 위해 여러 in vitro 및 in vivo 모델이 개발되었다11. 이 중에서, 매트릭스 겔 튜브 형성 분석(12)과 같은 2차원(2-D) 모델은 기능적 관형 구조를 형성할 수 없다. 뒷다리 허혈 모델(13,14)과 같은 동물 모델은 혈관신생 과정을 재현할 수 있지만, 복잡하고 레이저 스페클 혈류 이미징 시스템을 필요로 한다. 매트릭스 겔 플러그 분석과 같은 혈관 형태 형성의 3D 모델은 생체 내 혈관 신생 과정을 모방할 수 있는 간단한 플랫폼을 제공하지만(15), 혈관 신생을 검출하려면 면역조직화학 또는 면역형광 염색(16,17,18)이 필요하며, 이는 가변적이고 잘 시각화되지 않습니다.
여기에서, 우리는 혈관 세포를 매트릭스 겔과 혼합하고 마우스의 뒤쪽에 피하 주사하여 플러그를 형성하는 변형된 매트릭스 겔 플러그 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 플러그에서 혈관 세포는 기질을 분해하고, 증식하고, 이동하고, 자기 조직화하여 최종적으로 내부 환경에서 혈류가 흐르는 기능적인 혈관을 형성해야 합니다. 그 후, 형광 표지 덱스트란이 꼬리 정맥을 통해 주입되어 플러그를 통해 흐르고 라벨을 시각화하여 신생 혈관을 나타냅니다. 혈관신생의 함량은 혈관의 길이에 의해 정량적으로 평가될 수 있다. 이 방법은 2-D 혈관신생 모델(12)에서 생산될 수 없는 기능성 용기를 형성할 수 있고, 일반적인 매트릭스 겔 플러그 분석법(11)에서와 같이 복잡한 염색 과정을 필요로 하지 않는다. 또한 뒷다리 허혈 모델 13,14,19의 레이저 스페클 혈류 영상 시스템과 같은 값비싼 특정 기기가 필요하지 않습니다. 이 방법은 다재다능하고 비용이 저렴하며 정량화가 가능하고 수행하기 쉬우며 약물의 사전 또는 항 혈관 신생 능력을 결정하는 데 사용하거나 혈관 신생과 관련된 기계적 연구에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
염색 없이 in vivo 혈관신생의 정량적 평가를 위한 신뢰할 수 있고 편리한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 혈관 세포는 pro-angiogenic 또는 anti-angiogenic 시약의 존재 하에서 매트릭스 겔과 혼합된 다음 Nu/Nu 마우스의 뒤쪽에 피하 주사하여 겔 플러그를 형성했습니다(그림 1). 겔 플러그 형성 7일 후, 덱스트란-FITC를 정맥 주사하고 30분 동안 순환시켰다. 겔 플러그를 채취?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 저장성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Zhejiang Province, LY22H020005)과 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 81873466)의 지원을 받았다.
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
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