Anjiyogenez Çalışmaları için Modifiye In Vivo Matrix Jel Plug Testi
Summary
Burada sunulan yöntem, reaktiflerin anjiyogenez veya vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini in vivo boyamadan değerlendirebilir. Yöntem, neo-damarları veya vasküler sızıntıyı görselleştirmek için kuyruk damarı yoluyla dekstran-FITC enjeksiyonunu kullanır.
Abstract
İn vivo anjiyogenezi araştırmak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu karmaşık ve pahalıdır, özel ekipman gerektirir veya sonraki nicel analizler için gerçekleştirilmesi zordur. Burada, in vivo anjiyogenezi değerlendirmek için modifiye edilmiş bir matris jel tıkaç testi sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktiflerin varlığında veya yokluğunda matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra deri altından alıcı farelerin arkasına enjekte edildi. 7 gün sonra, dekstran-FITC içeren fosfat tampon salin kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve 30 dakika boyunca damarlarda dolaştırılır. Matris jel tıkaçları toplanır ve doku gömme jel ile gömülür, daha sonra lekelenmeden floresan tespiti için 12 μm’lik bölümler kesilir. Bu tahlilde, yüksek moleküler ağırlığa (~ 150.000 Da) sahip dekstran-FITC, uzunluklarını tespit etmek için fonksiyonel damarları belirtmek için kullanılabilirken, düşük moleküler ağırlığa (~ 4.400 Da) sahip dekstran-FITC, neo-damarların geçirgenliğini belirtmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol in vivo anjiyogenezin kantitatif çalışması için güvenilir ve uygun bir yöntem sağlayabilir.
Introduction
Önceden var olan damarlardan neo-damarların oluşum süreci olan anjiyogenez, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi, ateroskleroz, tümör gelişimi vb. gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte kritik bir rol oynar.1,2,3,4,5. Bu dinamik süreç, matrisin bozulması, vasküler hücre proliferasyonu, boru şeklindeki yapılar oluşturmak için göç ve kendi kendine örgütlenme ve neo-damarların stabilizasyonu dahil olmak üzere birkaç adımı içerir6. Anjiyogenezin teşvik edilmesinin miyokard enfarktüsü, inme ve diğer iskemik hastalıklarıntedavisinde kritik olduğu gösterilmiştir 7 anjiyogenezin inhibe edilmesi, kanserlerin8 ve romatizmal hastalıklarıntedavisinde umut verici bir strateji olarak kabul edilmiştir 9. Anjiyogenez, ilaç keşfi için düzenleyici bir ilke olarak kabul edilmiştir10. Bu nedenle, anjiyogenezin derecesini değerlendirmek için güvenilir ve uygun bir yöntemin oluşturulması, anjiyogeneze bağlı hastalıklarda mekanik araştırma veya ilaç keşfi için kritik öneme sahiptir.
Anjiyogenezi değerlendirmek için çeşitli in vitro ve in vivo modeller geliştirilmiştir11. Bunlar arasında, matris jel tüp oluşum deneyi12 gibi iki boyutlu (2-D) modeller, fonksiyonel boru şeklinde yapılar oluşturamaz. Arka bacak iskemi modeli13,14 gibi hayvan modelleri, anjiyogenez sürecini yeniden üretebilir, ancak karmaşıktır ve bir lazer benek kan akışı görüntüleme sistemi gerektirir. Matris jel tıkaç testi gibi vasküler morfogenezin 3D modelleri, in vivo15 anjiyogenez sürecini taklit edebilen basit bir platform sağlar, ancak anjiyogenezin saptanması, değişken ve kötü görselleştirilmiş immünohistokimya veya immünofloresan boyama 16,17,18 gerektirir.
Burada, vasküler hücrelerin matriks jel ile karıştırıldığı ve bir tıkaç oluşturmak için farelerin arkasına deri altına enjekte edildiği modifiye edilmiş bir matris jel tıkacı testi için bir protokol açıklıyoruz. Tıkaçta, vasküler hücrelerin matrisi bozması, çoğalması, göç etmesi ve nihayet iç ortamda kan akışı olan fonksiyonel damarlar oluşturmak için kendi kendini organize etmesi gerekir. Daha sonra, floresan etiketli dekstran, tıkaçtan akmak için kuyruk damarı yoluyla enjekte edilir ve etiket, neo-damarları belirtmek için görselleştirilir. Anjiyogenez içeriği, damarların uzunluğu ile kantitatif olarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, 2 boyutlu anjiyogenez modellerinde12 üretilemeyen fonksiyonel damarlar oluşturabilir ve sıradan matris jel tıkaç testinde11 olduğu gibi karmaşık boyama işlemine ihtiyaç duymaz. Ayrıca arka ekstremite iskemisi model13,14,19’da lazer benek kan akışı görüntüleme sistemi gibi pahalı özel aletler gerektirmez. Bu yöntem çok yönlü, düşük maliyetli, ölçülebilir ve gerçekleştirilmesi kolaydır ve ilaçların pro- veya anti-anjiyojenik kapasitesini belirlemek için kullanılabilir veya anjiyogenezde yer alan mekanik araştırmalarda kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anjiyogenezin kantitatif değerlendirmesi için in vivo boyamadan güvenilir ve kullanışlı bir yöntem sunuyoruz. Bu protokolde, vasküler hücreler pro-anjiyojenik veya anti-anjiyojenik reaktifler varlığında matriks jel ile karıştırıldı ve daha sonra jel tıkacı oluşturmak için Nu/Nu farelerin arkasına deri altına enjekte edildi (Şekil 1). 7 günlük jel tıkacı oluşumundan sonra, dekstran-FITC intravenöz olarak enjekte edildi ve 30 dakika boyunca sirküle edild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY22H020005) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81873466) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
References
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
