एंजियोजेनेसिस अध्ययन के लिए विवो मैट्रिक्स जेल प्लग परख में संशोधित
Summary
यहां प्रस्तुत विधि धुंधला हो जाने के बिना विवो में एंजियोजेनेसिस या संवहनी पारगम्यता पर अभिकर्मकों के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकती है। विधि नव-वाहिकाओं या संवहनी रिसाव की कल्पना करने के लिए पूंछ नस के माध्यम से डेक्सट्रान-एफआईटीसी इंजेक्शन का उपयोग करती है।
Abstract
विवो में एंजियोजेनेसिस की जांच के लिए कई मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश मॉडल जटिल और महंगे हैं, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, या बाद के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रदर्शन करना कठिन होता है। यहां हम विवो में एंजियोजेनेसिस का मूल्यांकन करने के लिए एक संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, संवहनी कोशिकाओं को प्रो-एंजियोजेनिक या एंटी-एंजियोजेनिक अभिकर्मकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में मैट्रिक्स जेल के साथ मिलाया गया था, और फिर प्राप्तकर्ता चूहों के पीछे चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिया गया था। 7 दिनों के बाद, डेक्सट्रान-एफआईटीसी युक्त फॉस्फेट बफर खारा पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है और 30 मिनट के लिए जहाजों में प्रसारित किया जाता है। मैट्रिक्स जेल प्लग एकत्र कर रहे हैं और ऊतक एम्बेडिंग जेल के साथ एम्बेडेड हैं, तो 12 माइक्रोन वर्गों धुंधला बिना प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए कटौती कर रहे हैं. इस परख में, उच्च आणविक भार (~ 150,000 दा) के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी का उपयोग उनकी लंबाई का पता लगाने के लिए कार्यात्मक जहाजों को इंगित करने के लिए किया जा सकता है, जबकि कम आणविक भार (~ 4,400 दा) के साथ डेक्सट्रान-एफआईटीसी का उपयोग नव-जहाजों की पारगम्यता को इंगित करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल विवो में एंजियोजेनेसिस के मात्रात्मक अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका प्रदान कर सकता है।
Introduction
एंजियोजेनेसिस, पहले से मौजूद जहाजों से नव-वाहिकाओं के गठन की प्रक्रिया, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जैसे कि भ्रूण विकास, घाव भरने, एथेरोस्क्लेरोसिस, ट्यूमर विकास, आदि1,2,3,4,5। इस गतिशील प्रक्रिया में कई कदम शामिल हैं, जिसमें मैट्रिक्स का क्षरण, संवहनी कोशिका प्रसार, प्रवास और स्व-संगठन ट्यूबलर संरचनाएं बनाने और नव-वाहिकाओं के स्थिरीकरण सहितशामिल हैं 6. एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने को मायोकार्डियल रोधगलन, स्ट्रोक और इस्केमिक रोगों के अन्य प्रकार के उपचार में महत्वपूर्ण होने के लिए प्रदर्शित किया गया है7 जबकि एंजियोजेनेसिस को रोकना कैंसर8 और संधिशोथरोगों 9 के उपचार में एक आशाजनक रणनीति माना गया है। एंजियोजेनेसिस को दवाकी खोज 10 के लिए एक आयोजन सिद्धांत माना गया है। इस प्रकार, एंजियोजेनेसिस की सीमा का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक विधि का निर्माण एंजियोजेनेसिस-निर्भर रोगों में यांत्रिक अनुसंधान या दवा की खोज के लिए महत्वपूर्ण है।
एंजियोजेनेसिस11 का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो और इन विवो मॉडल में कई विकसित किए गए हैं। इनमें से, दो-आयामी (2-डी) मॉडल, जैसे मैट्रिक्स जेल ट्यूब गठन परख12, कार्यात्मक ट्यूबलर संरचनाएं नहीं बना सकते हैं। इस तरह के हिंद अंग इस्किमिया मॉडल13,14 के रूप में पशु मॉडल, एंजियोजेनेसिस प्रक्रिया को पुन: पेश कर सकते हैं, लेकिन जटिल हैं और एक लेजर धब्बेदार रक्त प्रवाह इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता होती है. मैट्रिक्स जेल प्लग परख की तरह संवहनी morphogenesis के 3 डी मॉडल, विवो15 में एंजियोजेनेसिस की प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं कि एक सरल मंच प्रदान करते हैं, लेकिन एंजियोजेनेसिस का पता लगाने immunohistochemistry या immunofluorescenceधुंधला 16,17,18, जो चर और खराब कल्पना कर रहे हैं की आवश्यकता है.
यहां, हम एक संशोधित मैट्रिक्स जेल प्लग परख के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां संवहनी कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल के साथ मिलाया गया था और प्लग बनाने के लिए चूहों के पीछे चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिया गया था। प्लग में, संवहनी कोशिकाओं को आंतरिक वातावरण में रक्त प्रवाह के साथ कार्यात्मक वाहिकाओं को बनाने के लिए मैट्रिक्स को नीचा दिखाने, प्रसार करने, प्रवास करने और आत्म-व्यवस्थित करने की आवश्यकता होती है। इसके बाद, फ्लोरोसेंट-लेबल वाले डेक्सट्रान को प्लग के माध्यम से प्रवाह करने के लिए पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है, और लेबल को नव-वाहिकाओं को इंगित करने के लिए कल्पना की जाती है। एंजियोजेनेसिस की सामग्री का मात्रात्मक रूप से जहाजों की लंबाई से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह विधि कार्यात्मक जहाजों है कि 2 डी एंजियोजेनेसिस मॉडल12 में उत्पादन नहीं किया जा सकता फार्म कर सकते हैं, और साधारण मैट्रिक्स जेल प्लग परख11 में के रूप में जटिल दाग प्रक्रिया की जरूरत नहीं है. यह भी हिंद अंग इस्किमिया मॉडल 13,14,19 में लेजर धब्बेदार रक्त प्रवाह इमेजिंग प्रणाली की तरह महंगे विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं है. यह विधि बहुमुखी, कम लागत वाली, मात्रात्मक और प्रदर्शन करने में आसान है, और इसका उपयोग दवाओं के समर्थक या एंटी-एंजियोजेनिक क्षमता को निर्धारित करने या एंजियोजेनेसिस में शामिल यांत्रिक अनुसंधान में उपयोग करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम धुंधला हो जाना बिना विवो में एंजियोजेनेसिस के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, संवहनी कोशिकाओं को प्रो-एंजियोजेनिक या एंटी-एंज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया (LY22H020005), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
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