O cultivo em larga escala de nematoides para estudar seus comportamentos coletivos
Summary
Aqui, um sistema é relatado para estudar os comportamentos coletivos de nematoides através de cultivá-los a granel usando meio ágar ração para cães. Este sistema permite aos pesquisadores propagar um grande número de vermes dauer e pode ser aplicado a Caenorhabditis elegans e outras espécies relacionadas.
Abstract
Os animais exibem comportamentos coletivos dinâmicos, como observado em bandos de aves, cardumes de peixes e multidões de humanos. Os comportamentos coletivos dos animais têm sido investigados nos campos da biologia e da física. Em laboratório, os pesquisadores usaram vários animais-modelo, como a mosca-da-fruta e o peixe-zebra, por aproximadamente um século, mas continua sendo um grande desafio estudar o comportamento coletivo complexo em grande escala orquestrado por esses animais-modelo geneticamente tratáveis. Este artigo apresenta um protocolo para criar um sistema experimental de comportamentos coletivos em Caenorhabditis elegans. Os vermes propagados sobem na tampa da placa de Petri e apresentam comportamento de enxame coletivo. O sistema também controla as interações e comportamentos dos vermes, alterando a umidade e a estimulação luminosa. Esse sistema nos permite examinar os mecanismos subjacentes aos comportamentos coletivos, alterando as condições ambientais e examinando os efeitos da locomoção em nível individual sobre os comportamentos coletivos usando mutantes. Assim, o sistema é útil para futuras pesquisas em física e biologia.
Introduction
Tanto os não-cientistas quanto os cientistas são fascinados pelos comportamentos coletivos dos animais, como em bandos de pássaros e cardumes de peixes. Comportamentos coletivos têm sido analisados em uma ampla gama de campos, incluindo física, biologia, matemática e robótica. Em particular, a física da matéria ativa é um campo de pesquisa crescente que se concentra em sistemas compostos por elementos autoproppelidos, isto é, sistemas dissipativos, como bandos de aves, cardumes de peixes, biofilmes de bactérias móveis, citoesqueletos compostos por moléculas ativas e grupos de coloides autoproppelidos. A teoria da física da matéria ativa sustenta que, por mais complexos que sejam os comportamentos dos indivíduos, os movimentos coletivos de um grande número de seres vivos são governados por um pequeno número de regras simples. Por exemplo, o modelo de Vicsek, um candidato para uma descrição unificada do movimento coletivo de partículas autopropelidas, prevê que a interação de alinhamento de curto alcance de objetos em movimento é necessária para formar uma fase ordenada de longo alcance com flutuação excêntrica em 2D, como em rebanhos de animais1. Abordagens experimentais de cima para baixo relativas à física da matéria ativa estão se desenvolvendo rapidamente. Experimentos anteriores confirmaram a formação de uma fase ordenada de longo alcance em Escherichia coli2. Outros trabalhos recentes empregaram células 3,4, bactérias5, coloides móveis6 ou proteínas em movimento 7,8. Modelos mínimos simples, como o modelo de Vicsek, descreveram com sucesso esses fenômenos reais. Em contraste com esses sistemas experimentais unicelulares, comportamentos coletivos de animais são geralmente observados na natureza, pois ninguém poderia esperar realizar experimentos controlados com 10.000 aves ou peixes reais.
Os biólogos compartilham o mesmo interesse que os físicos: como os indivíduos interagem uns com os outros e se comportam funcionalmente como um grupo. Um dos campos de pesquisa tradicionais para analisar o comportamento individual é a neurociência, na qual os mecanismos subjacentes ao comportamento têm sido examinados nos níveis neuronal e molecular. Muitas abordagens neurocientíficas ascendentes foram desenvolvidas até agora. Abordagens de cima para baixo em física e abordagens de baixo para cima em biologia podem ser facilitadas usando animais modelo como a mosca-da-fruta, o verme Caenorhabditis elegans e o camundongo9. No entanto, há poucos achados sobre o comportamento coletivo em larga escala desses animais modelo emlaboratório10; Ainda é difícil preparar animais modelo geneticamente tratáveis em larga escala em laboratório. Portanto, nas pesquisas atuais sobre comportamentos coletivos em biologia e física, tem sido difícil para os cientistas que geralmente fazem pesquisas em laboratório estudar os comportamentos coletivos dos animais.
Neste estudo, estabelecemos um método para o cultivo em larga escala de nematoides para estudar seus comportamentos coletivos. Esse sistema permite alterar as condições ambientais e examinar o efeito da locomoção em nível individual sobre comportamentos coletivos usando mutantes10. Em física da matéria ativa, os parâmetros do modelo matemático podem ser controlados tanto em experimentos quanto em simulações, o que permite a verificação desse modelo para identificação de descrições unificadas. A genética é utilizada para entender o mecanismo do circuito neural subjacente ao comportamento coletivo11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, mostramos um protocolo para a preparação de um sistema para o comportamento coletivo em larga escala de C. elegans em laboratório. O método baseado em DFA foi originalmente estabelecido com Caenorhabditis japonica14 e Neoaplectana carpocapsae Weiser15, ambos animais não modelo. No entanto, esse método não foi aplicado para investigar comportamentos coletivos. O C. elegans é um animal modelo geneticamente tratável11,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Centro de Genética Caenorhabditis pelo fornecimento das cepas utilizadas neste estudo. Esta publicação foi apoiada pelo projeto JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (grant number JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid on the Innovative Areas “Science of Soft Robot” (grant number JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (grant number JP23H03845), the PRIME from Japan Agency for Medical Research and Development (grant number JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Program (grant number JPMJMI22G3), e Programa JST-FOREST (bolsa número JPMJFR214R).
Materials
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP] | author | ZX899 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively |
| N2 Bristrol | Caenorhabditis Genetics Center | Wild-type C. elegans strain | |
| For worm cultivation | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| All-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | For optogenetics |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| Dog food | Nihon Pet Food | VITA-ONE | For preparation of dog food agar medium |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Observation | |||
| Computer | CT solution | CS6229 | Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM |
| CMOS Camera | Hamamatsu photonics | ORCA-Lightning C14120-20P | For data acquisition |
| CMOS Camera | Olympus | DP74 | For data acquisition |
| Microscope with SZX-MGFP set | Olympus | MVX10 | For data acquisition |
| x2 Objective lens | Olympus | MV PLAPO 2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Shutter control | |||
| Shutter | OptoSigma | BSH2-RIX | For controlling temporal pattern of light illumination |
| Shutter controller | OptoSigma | SSH-C2B-A | For controlling temporal pattern of light illumination |
| Temperature control | |||
| Peltier temperature controller unit | VICS | WLVPU-30 | For controlling humidity inside a Petri plate |
| UNI-THEMO CONTROLLER | Ampere | UTC-100 | For controlling humidity inside a Petri plate |
| Data acquisition software | |||
| HCImage | Hamamatsu photonics | For data acquisition |
References
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