Perfil Fenotípico de Neurônios Dopaminérgicos do Mesencéfalo Derivados de Células-Tronco Humanas
Summary
Este protocolo descreve a cultura celular de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo humano, seguida de coloração imunológica e geração de perfis fenotípicos neuronais a partir de imagens microscópicas adquiridas de alto conteúdo, permitindo a identificação de variações fenotípicas devido a modulações genéticas ou químicas.
Abstract
A doença de Parkinson (DP) está ligada a uma série de processos biológicos celulares que causam perda de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo (mDA). Muitos modelos celulares atuais de DP in vitro carecem de complexidade e não levam em conta múltiplos fenótipos. O perfil fenotípico em neurônios mDA derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC) pode abordar essas deficiências medindo simultaneamente uma variedade de fenótipos neuronais em um tipo de célula relevante para DP em paralelo. Aqui, descrevemos um protocolo para obter e analisar perfis fenotípicos de neurônios mDA humanos comercialmente disponíveis. Um painel de coloração fluorescente neuron-específico é usado para visualizar os fenótipos nucleares, α-sinucleína, tirosina hidroxilase (TH) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2) relacionados. O protocolo de perfil fenotípico descrito é escalável, pois utiliza placas de 384 poços, manuseio automático de líquidos e microscopia de alto rendimento. A utilidade do protocolo é exemplificada usando neurônios mDA de doadores saudáveis e neurônios mDA portadores da mutação G2019S ligada a PD no gene Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2). Ambas as linhagens celulares foram tratadas com o inibidor de quinase LRRK2 PFE-360 e as alterações fenotípicas foram medidas. Além disso, demonstramos como perfis fenotípicos multidimensionais podem ser analisados usando métodos de classificação supervisionada orientados por clustering ou aprendizado de máquina. O protocolo descrito interessará particularmente aos pesquisadores que trabalham na modelagem de doenças neuronais ou no estudo dos efeitos de compostos químicos em neurônios humanos.
Introduction
Uma variedade de processos biológicos celulares são perturbados na doença de Parkinson (DP). Por exemplo, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, defeitos de degradação proteica, interrupção do tráfego vesicular e função endolisossômica têm sido associados à perda de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos (mDA), são comumente observados na DP1. Portanto, a DP parece envolver múltiplos mecanismos patológicos que podem interagir e piorar uns com os outros. Uma maneira útil de investigar essa interação mecanicista é a criação de uma impressão digital fenotípica abrangente ou perfil de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos (mDA).
O perfil fenotípico é uma abordagem que envolve a criação de um perfil de uma amostra com base em uma coleção de características mensuráveis e, em segundo lugar, envolve fazer previsões sobre uma amostra com base nesse perfil 2,3. O objetivo da criação de perfis é capturar uma gama diversificada de características, algumas das quais podem não ter sido previamente associadas a uma doença ou tratamento3. Como resultado, o perfilamento pode revelar processos biológicos inesperados. O perfil fenotípico tipicamente depende de células coradas fluorescentemente, e ensaios padronizados, como o Cell Painting, foram desenvolvidos para criar perfis fenotípicos4. Recentemente, o perfil fenotípico tem sido aplicado, por exemplo, para a caracterização de pequenas moléculas ou a predição precisa de subtipos de DP apenas com base em fibroblastos derivados do paciente 5,6. Apesar desses avanços, o perfil fenotípico raramente tem sido aplicado a células diferenciadas pós-mitóticas, como neurônios mDA derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) que expressam mutações ligadas à DP, como LRRK2 G2019S. Desafios significativos dos modelos derivados de iPSC incluem a presença de características patológicas sutis ou variáveis entre lotes de diferenciação ou genótipos, e o fato de que fenótipos isolados de DP não capturam toda a complexidade da doença. Além disso, embora os modelos neuronais de iPSC sejam fisiologicamente relevantes, eles raramente são usados em processos de descoberta de drogas para DP devido a preocupações com a complexidade técnica 7,8.
Desenvolvemos previamente uma metodologia robusta para medir múltiplos fenótipos fisiopatológicos relacionados à DP em neurônios humanos mDA que são sensíveis a alterações fenotípicas genéticas e químicas induzidas por compostosquímicos9. Este artigo descreve em detalhes uma versão otimizada dessa metodologia para criar perfis fenotípicos a partir de neurônios mDA (Figura 1). Este protocolo apresenta várias vantagens em relação às abordagens de perfil fenotípico descritas anteriormente, tais como o uso de neurônios mDA de alta qualidade e reprodutibilidade técnica. Pela primeira vez, este protocolo permite o perfil fenotípico em neurônios mDA pós-mitóticos fisiologicamente relevantes após perturbações químicas de forma altamente escalável. Neurônios mDA totalmente diferenciados e criopreservados estão comercialmente disponíveis, diminuindo significativamente a variabilidade da diferenciação lote a lote. Em segundo lugar, a variabilidade técnica pode ser ainda mais reduzida usando um desenho experimental bem definido (isto é, duração da cultura ou evitando poços de borda), manuseio automatizado de líquidos e microscopia automatizada. Adicionalmente, as etapas iniciais da análise do perfil fenotípico usando abordagens de agrupamento não supervisionado ou classificação supervisionada são descritas aqui, indicando como os dados de perfil fenotípico podem ser analisados. Este protocolo será útil para pesquisadores interessados em alterações fenotípicas de neurônios mDA induzidas por perturbações genéticas ou químicas, especificamente quando uma configuração de estudo altamente escalável é necessária, por exemplo, durante campanhas de triagem ou quando os efeitos de um número menor de compostos devem ser estudados, por exemplo, para determinar efeitos tóxicos. Em resumo, espera-se que a aplicação do perfil fenotípico de neurônios humanos seja uma técnica valiosa para estudar fenótipos complexos relacionados à doença e caracterizar os efeitos celulares de candidatos a fármacos.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo experimental para gerar perfis fenotípicos baseados em imagens a partir de neurônios mDA humanos derivados de iPSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
O perfil fenotípico é uma técnica para medir um grande número de fenótipos em células por meio da aplicação de colorações fluorescentes, microscopia e análise de imagens3. Perfis fenotípicos podem ser obtidos e comparados entre linhagens celulares ou outras condições experimentais para entender mudanças complexas na biologia celular que podem passar despercebidas ao usar uma única leitura. Descrevemos aqui a aplicação do perfil fenotípico em neurônios mDA humanos derivados de i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a todos os colegas da Ksilink por sua valiosa ajuda e discussões que levaram ao desenho do protocolo apresentado.
Materials
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse – Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit – Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
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