Fænotypisk profilering af humane stamcelleafledte dopaminerge neuroner i midthjernen

Summary

Denne protokol beskriver celledyrkning af humane dopaminerge neuroner i midthjernen, efterfulgt af immunologisk farvning og generering af neuronale fænotypiske profiler fra erhvervede mikroskopiske billeder med højt indhold, der muliggør identifikation af fænotypiske variationer på grund af genetiske eller kemiske modulationer.

Abstract

Parkinsons sygdom (PD) er forbundet med en række cellebiologiske processer, der forårsager dopaminerge (mDA) neurontab i midthjernen. Mange nuværende in vitro PD-cellulære modeller mangler kompleksitet og tager ikke højde for flere fænotyper. Fænotypisk profilering i humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte mDA-neuroner kan løse disse mangler ved samtidig at måle en række neuronale fænotyper i en PD-relevant celletype parallelt. Her beskriver vi en protokol til opnåelse og analyse af fænotypiske profiler fra kommercielt tilgængelige humane mDA-neuroner. Et neuronspecifikt fluorescerende farvningspanel bruges til at visualisere de nukleare, α-synuclein, tyrosinhydroxylase (TH) og mikrotubulusassocierede protein 2 (MAP2) relaterede fænotyper. Den beskrevne fænotypiske profileringsprotokol er skalerbar, da den bruger 384-brøndplader, automatisk væskehåndtering og højkapacitetsmikroskopi. Protokollens anvendelighed er eksemplificeret ved hjælp af sunde donor mDA-neuroner og mDA-neuroner, der bærer den PD-bundne G2019S-mutation i det leucinrige gentagelseskinase 2 (LRRK2) gen. Begge cellelinjer blev behandlet med LRRK2-kinasehæmmeren PFE-360, og fænotypiske ændringer blev målt. Derudover demonstrerer vi, hvordan multidimensionelle fænotypiske profiler kan analyseres ved hjælp af klynger eller maskinlæringsdrevne overvågede klassificeringsmetoder. Den beskrevne protokol vil især interessere forskere, der arbejder med neuronal sygdomsmodellering eller studerer kemiske sammensatte virkninger i humane neuroner.

Introduction

En række cellebiologiske processer forstyrres ved Parkinsons sygdom (PD). For eksempel er mitokondriel dysfunktion, oxidativ stress, proteinnedbrydningsdefekter, forstyrrelse af vesikulær handel og endolysosomal funktion blevet forbundet med dopaminerge (mDA) neurontab i midthjernen, almindeligt observeret i PD¹. Derfor synes PD at involvere flere sygdomsmekanismer, der kan interagere med og forværre hinanden. En nyttig måde at undersøge dette mekanistiske samspil på er skabelsen af et omfattende fænotypisk fingeraftryk eller profil af dopaminerge (mDA) neuroner i midthjernen.

Fænotypisk profilering er en tilgang, der involverer oprettelse af en profil af en prøve baseret på en samling af målbare egenskaber, og for det andet involverer det at forudsige en prøve baseret på denne profil ^2,3. Målet med profilering er at fange en bred vifte af funktioner, hvoraf nogle måske ikke tidligere har været forbundet med en sygdom eller behandling³. Som følge heraf kan profilering afsløre uventede biologiske processer. Fænotypisk profilering er typisk afhængig af fluorescerende farvede celler, og standardiserede assays, såsom cellemaleri, er blevet udviklet til at skabe fænotypiske profiler⁴. For nylig er fænotypisk profilering for eksempel blevet anvendt til karakterisering af små molekyler eller nøjagtig forudsigelse af PD-undertyper udelukkende baseret på patientafledte fibroblaster ^5,6. På trods af disse fremskridt er fænotypisk profilering sjældent blevet anvendt på postmitotiske differentierede celler, såsom humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte mDA-neuroner, der udtrykker PD-bundne mutationer såsom LRRK2 G2019S. Væsentlige udfordringer ved iPSC-afledte modeller omfatter tilstedeværelsen af subtile eller variable patologiske træk på tværs af differentieringsbatcher eller genotyper og det faktum, at isolerede PD-fænotyper ikke fanger sygdommens fulde kompleksitet. Selvom iPSC neuronale modeller er fysiologisk relevante, anvendes de sjældent i PD-lægemiddelopdagelsesprocesser på grund af bekymringer om teknisk kompleksitet ^7,8.

Vi har tidligere udviklet en robust metode til at måle flere PD-relaterede patofysiologiske fænotyper i humane mDA-neuroner, der både er følsomme over for genetiske og kemiske sammensætningsinducerede fænotypiske ændringer⁹. Denne artikel beskriver detaljeret en yderligere optimeret version af denne metode til at oprette fænotypiske profiler fra mDA-neuroner (figur 1). Denne protokol har flere fordele i forhold til de tidligere beskrevne fænotypiske profileringsmetoder, såsom brugen af mDA-neuroner af høj kvalitet og teknisk reproducerbarhed. For første gang muliggør denne protokol fænotypisk profilering i fysiologisk relevante postmitotiske mDA-neuroner efter kemiske forstyrrelser på en meget skalerbar måde. Fuldt differentierede og kryopræserverede mDA-neuroner er kommercielt tilgængelige, hvilket signifikant reducerer batch-til-batch-differentieringsvariabilitet. For det andet kan teknisk variabilitet reduceres yderligere ved at anvende et veldefineret eksperimentelt design (dvs. dyrkningsvarighed eller undgå kantbrønde), automatiseret væskehåndtering og automatiseret mikroskopi. Derudover er de indledende trin i fænotypisk profilanalyse ved hjælp af uovervåget klyngedannelse eller overvåget klassificeringsmetoder skitseret her, hvilket angiver, hvordan fænotypiske profileringsdata kan analyseres. Denne protokol vil være nyttig for forskere, der er interesseret i fænotypiske ændringer af mDA-neuroner induceret af genetiske eller kemiske forstyrrelser, specifikt når der kræves en meget skalerbar undersøgelsesopsætning, for eksempel under screeningskampagner, eller når virkningerne af et mindre antal forbindelser skal undersøges, for eksempel for at bestemme toksiske virkninger. Sammenfattende forventes det, at anvendelsen af fænotypisk profilering af humane neuroner er en værdifuld teknik til at studere komplekse sygdomsrelaterede fænotyper og karakterisere de cellulære virkninger af lægemiddelkandidater.

Figur 1: Skematisk skildring af den eksperimentelle protokol til generering af billedbaserede fænotypiske profiler fra humane iPSC-afledte mDA-neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Forberedelse af medium og plader til neuronsåning (dag 1) For at forberede pladerne til neuronsåning på dag-1, varm Laminin til stuetemperatur (RT) lige før brug. Lamininopløsningen fremstilles ved at fortynde Lamininstamopløsningen (0,1 mg/ml) 1/10 i kold PBS+/+ (med Ca 2+ og Mg2+).BEMÆRK: Alle reagenser er angivet i materialetabellen. Sammensætningen af opløsninger og buffere er beskrevet i tabel 1-4. Derefter t…

Representative Results

Fænotypisk profilering i mDA-neuroner er en effektiv måde at kvantificere flere aspekter af cellulær biologi og deres ændringer under den eksperimentelle modulering. For at eksemplificere denne metode gjorde denne undersøgelse brug af kryopræserverede LRRK2 G2019S og raske donor mDA-neuroner. Disse neuroner er blevet differentieret i ca. 37 dage, er postmitotiske og ekspressive neuronale markører (TUBB3 og MAP2) og dopaminerge neuronmarkører, herunder tyrosinhydroxylase (TH) i kombination med FOXA2, mens gliamark…

Discussion

Fænotypisk profilering er en teknik til at måle et stort antal fænotyper i celler ved at anvende fluorescerende farvninger, mikroskopi og billedanalyse³. Fænotypiske profiler kan opnås og sammenlignes på tværs af cellelinjer eller andre eksperimentelle betingelser for at forstå komplekse ændringer i cellulær biologi, der kan gå ubemærket hen, når man bruger en enkelt udlæsning. Her beskriver vi anvendelsen af fænotypisk profilering til humane iPSC-afledte mDA-neuroner, en celletype,…

Materials

Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse – Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit – Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.