היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים
Summary
לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג’ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.
Abstract
טיפול קונבנציונלי בהתחדשות עצם באמצעות תאי גזע מזנכימליים (MSCs) קשה ליישום על פגמים בעצם גדולים מהגודל הקריטי מכיוון שאין לו מנגנון לגרימת אנגיוגנזה. השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מ-MSCs גורמת לאנגיוגנזה וליצירת עצם in vivo באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית (ECO). לכן, גישה זו בתיווך אקולוגי עשויה להיות טיפול מבטיח להתחדשות עצם בעתיד. היבט חשוב ביישום הקליני של גישה זו בתיווך אקולוגי הוא קביעת פרוטוקול להכנת מספיק סחוס להשתלה כדי לתקן את הפגם בעצם. במיוחד לא מעשי לתכנן מסה אחת של סחוס מושתל בגודל המתאים לצורת פגם העצם בפועל. לכן, הסחוס להשתלה חייב להיות בעל תכונה של יצירת עצם באופן אינטגרלי כאשר חלקים מרובים מושתלים. הידרוג’לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית כדי לעמוד בדרישות הקליניות. למרות שהידרוג’לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC in vitro ו- ECO in vivo, חומר הפיגום האופטימלי שיענה על הצרכים של יישומים קליניים טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא מרכיב חיוני במטריצה החוץ תאית של הסחוס והיא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית. כאן, אנו מראים כי הידרוג’ל HA יש תכונות מצוינות לתמוך בהתמיינות חוץ גופית של רקמת סחוס מבוססת MSC ולקדם היווצרות עצם אנדוכונדרלית in vivo.
Introduction
עצם אוטולוגית היא עדיין תקן הזהב לתיקון מומים בעצם עקב טראומה, מומים מולדים וכריתה כירורגית. עם זאת, להשתלת עצם אוטוגנית יש מגבלות משמעותיות, כולל כאב תורם, סיכון לזיהום ונפח עצם מוגבל שניתן לבודד מהחולים 1,2,3,4. ביו-חומרים רבים פותחו כתחליפי עצם, המשלבים פולימרים טבעיים או סינתטיים עם חומרים מינרליים כגון סידן פוספט או הידרוקסיאפטיט 5,6. היווצרות עצם בחומרים מהונדסים אלה מושגת בדרך כלל באמצעות החומר המינרלי כחומר ראשוני כדי לאפשר לתאי גזע להתמיין ישירות לאוסטאובלסטים באמצעות תהליך האוסיפיקציה התוך-ממברנית (IMO)7. תהליך זה חסר את השלב האנגיוגני, וכתוצאה מכך אין מספיק וסקולריזציה in vivo של השתל לאחר ההשתלה 8,9,10, ולכן גישות המשתמשות בתהליך כזה עשויות שלא להיות אופטימליות לטיפול במומים גדולים בעצמות 11.
אסטרטגיות המיושמות כדי לשחזר את תהליך האוסיפיקציה האנדוכונדרלית (ECO), מנגנון מולד בשלד במהלך הפיתוח, הוכחו כמתגברות על בעיות משמעותיות הקשורות לגישות מסורתיות מבוססות IMO. ב- ECO, כונדרוציטים בתבנית הסחוס משחררים גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), אשר מקדם הסננה וסקולרית ועיצוב מחדש של תבנית הסחוס לעצם12. הגישה בתיווך אקולוגי לאוסטאוגנזה באמצעות עיצוב מחדש של סחוס ואנגיוגנזה, המופעלת גם במהלך תיקון שבר, משתמשת ברקמת סחוס שנוצרה באופן מלאכותי שמקורה ב- MSCs כחומר ראשוני. כונדרוציטים יכולים לסבול היפוקסיה במומים בעצמות, לגרום לאנגיוגנזה ולהמיר שתל סחוס ללא כלי דם לרקמה אנגיוגנית. מחקרים רבים דיווחו כי שתלי סחוס מבוססי MSC מייצרים עצם in vivo על ידי יישום תוכנית ECO כזו 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
דרישה חיונית ליישום קליני של גישה זו בתיווך אקולוגי היא כיצד להכין את הכמות הרצויה של שתל סחוס בסביבה קלינית. הכנת סחוס קליני בגודל המתאים לפגם העצם בפועל אינה מעשית. לכן, סחוס השתל חייב ליצור עצם באופן אינטגרלי כאשר מושתלים שברים מרובים22. הידרוג’לים עשויים להיות כלי אטרקטיבי להרחבת שתלים מהונדסים רקמות לאוסיפיקציה אנדוכונדרלית. הידרוג’לים רבים ממקור טבעי תומכים בהיווצרות סחוס MSC במבחנה ו- ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; עם זאת, חומר התמיכה האופטימלי שיעמוד בדרישות היישום הקליני טרם נקבע. חומצה היאלורונית (HA) היא פוליסכריד מתכלה ותואם ביולוגית הנמצא במטריצה החוץ תאית של סחוס33. חומצה היאלורונית מקיימת אינטראקציה עם MSCs באמצעות קולטני שטח כגון CD44 לתמיכה בהתמיינות כונדרוגנית 25,26,28,30,31,32,34. בנוסף, פיגומים HA מקדמים התמיינות אוסטאוגנית בתיווך IMO של תאי גזע אנושיים ממוך השן35, ופיגומים בשילוב עם קולגן מקדמים אוסטאוגנזה36,37 בתיווך אקולוגי.
כאן, אנו מציגים שיטה להכנת הידרוג’לים HA באמצעות MSCs אנושיים בוגרים שמקורם במח עצם והשימוש בהם עבור chondrogenesis in vitro hypertrophic ולאחר מכן ossification endochondral in vivo38. השווינו את המאפיינים של חומצה היאלורונית לאלה של קולגן, חומר הנמצא בשימוש נרחב בהנדסת רקמת עצם עם MSCs וחומר שימושי להרחבת שתלים מלאכותיים עבור אוסיפיקציה אנדוכונדרלית17. במודל עכבר מדוכא חיסון, מבני HA וקולגן שנזרעו עם MSCs אנושיים הוערכו עבור פוטנציאל ECO in vivo על ידי השתלה תת עורית. התוצאות מראות כי הידרוג’ל HA מצוין כפיגום עבור MSCs ליצירת שתלי סחוס מלאכותיים המאפשרים היווצרות עצם באמצעות ECO.
הפרוטוקול מחולק לשני שלבים. ראשית, מבנים של MSCs אנושיים שנזרעו על הידרוג’ל היאלורונן מוכנים ומובחנים לסחוס היפרטרופי במבחנה. לאחר מכן, המבנים המובחנים מושתלים באופן תת-עורי במודל עירום כדי לגרום לאוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
שימוש בחומרי פיגומים מתאימים המקדמים את המעבר מסחוס היפרטרופי לעצם הוא גישה מבטיחה להרחבת שתלי סחוס היפרטרופיים מהונדסים מבוססי MSC ולטיפול במומי עצם בגודל משמעותי מבחינה קלינית. כאן, אנו מראים כי HA הוא חומר פיגום מצוין לתמיכה בהתמיינות של רקמת סחוס היפרטרופית מבוססת MSC במבחנה ולקידו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי (KAKENHI) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מס. JP19K10259 ו- 22K10032 ל- MAI).
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
References
- Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
- Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
- Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
- Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
- Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
- Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
- Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host’s vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
- Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues–the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
- Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
- Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
- Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
- Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
- Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
- Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
- Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
- van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
- Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
- Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
- Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
- Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
- Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
- Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
- Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
- Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
- Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton’s jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
- Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
- Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
- Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
- La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
- Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O’Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
- Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
- Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
- Zarembinski, T., Skardal, A. . Hydrogels – Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
- Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
- Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
- Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
- Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
- Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
- Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).
