La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l’impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.
La terapia convenzionale di rigenerazione ossea che utilizza cellule staminali mesenchimali (MSC) è difficile da applicare a difetti ossei di dimensioni superiori a quelle critiche perché non ha un meccanismo per indurre l’angiogenesi. L’impianto di tessuto cartilagineo artificiale fabbricato da MSC induce l’angiogenesi e la formazione ossea in vivo tramite ossificazione endocondrale (ECO). Pertanto, questo approccio ECO-mediato potrebbe essere una promettente terapia di rigenerazione ossea in futuro. Un aspetto importante dell’applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è la definizione di un protocollo per la preparazione di una quantità sufficiente di cartilagine da impiantare per riparare il difetto osseo. In particolare, non è pratico progettare una singola massa di cartilagine innestata di dimensioni conformi alla forma del difetto osseo effettivo. Pertanto, la cartilagine da trapiantare deve avere la proprietà di formare integralmente l’osso quando vengono impiantati più pezzi. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l’ossificazione endocondrale per soddisfare i requisiti clinici. Sebbene molti idrogel di derivazione naturale supportino la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo, il materiale ottimale per lo scaffold per soddisfare le esigenze delle applicazioni cliniche deve ancora essere determinato. L’acido ialuronico (HA) è un componente cruciale della matrice extracellulare della cartilagine ed è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile. Qui, mostriamo che gli idrogel di HA hanno eccellenti proprietà per supportare la differenziazione in vitro del tessuto cartilagineo a base di MSC e promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo.
L’osso autologo è ancora il gold standard per la riparazione di difetti ossei dovuti a traumi, difetti congeniti e resezione chirurgica. Tuttavia, l’innesto osseo autogeno presenta limitazioni significative, tra cui il dolore del donatore, il rischio di infezione e il volume osseo limitato che può essere isolato dai pazienti 1,2,3,4. Numerosi biomateriali sono stati sviluppati come sostituti ossei, combinando polimeri naturali o sintetici con materiali mineralizzati come il fosfato di calcio o l’idrossiapatite 5,6. La formazione ossea in questi materiali ingegnerizzati viene solitamente ottenuta utilizzando il materiale mineralizzato come materiale di priming per consentire alle cellule staminali di differenziarsi direttamente in osteoblasti attraverso il processo di ossificazione intramembrana (IMO)7. Questo processo manca della fase angiogenica, con conseguente insufficiente vascolarizzazione in vivo dell’innesto dopo l’impianto 8,9,10 e, pertanto, gli approcci che utilizzano tale processo potrebbero non essere ottimali per il trattamento di grandi difetti ossei 11.
Le strategie applicate per ricapitolare il processo di ossificazione endocondrale (ECO), un meccanismo innato nella scheletrogenesi durante lo sviluppo, hanno dimostrato di superare problemi significativi associati agli approcci tradizionali basati sull’IMO. Nell’ECO, i condrociti nel modello di cartilagine rilasciano il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), che promuove l’infiltrazione vascolare e il rimodellamento del modello di cartilagine nell’osso12. L’approccio ECO-mediato all’osteogenesi attraverso il rimodellamento della cartilagine e l’angiogenesi, che viene attivato anche durante la riparazione delle fratture, utilizza tessuto cartilagineo creato artificialmente derivato da MSC come materiale di priming. I condrociti possono tollerare l’ipossia nei difetti ossei, indurre l’angiogenesi e convertire un innesto di cartilagine senza vascolare in tessuto angiogenico. Numerosi studi hanno riportato che gli innesti di cartilagine a base di MSC generano osso in vivo implementando un tale programma ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Un requisito essenziale per l’applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è come preparare la quantità desiderata di innesto di cartilagine in un contesto clinico. La preparazione di cartilagine clinica di dimensioni che si adattino al difetto osseo effettivo non è pratica. Pertanto, la cartilagine dell’innesto deve formare integralmente l’osso quando vengono impiantati più frammenti22. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l’ossificazione endocondrale. Molti idrogel di derivazione naturale supportano la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Tuttavia, il materiale di supporto ottimale per soddisfare i requisiti dell’applicazione clinica è rimasto indeterminato. L’acido ialuronico (HA) è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile presente nella matrice extracellulare della cartilagine33. L’acido ialuronico interagisce con le MSC tramite recettori di superficie come CD44 per supportare la differenziazione condrogenica 25,26,28,30,31,32,34. Inoltre, gli scaffold HA promuovono la differenziazione osteogenica mediata da IMO delle cellule staminali della polpa dentale umana35 e gli scaffold combinati con il collagene promuovono l’osteogenesi ECO-mediata36,37.
Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di idrogel di HA utilizzando MSC umane adulte derivate dal midollo osseo e il loro utilizzo per la condrogenesi ipertrofica in vitro e la successiva ossificazione endocondrale in vivo38. Abbiamo confrontato le caratteristiche dell’HA con quelle del collagene, un materiale ampiamente applicato nell’ingegneria del tessuto osseo con MSC e un materiale utile per scalare gli innesti artificiali per l’ossificazione endocondrale17. In un modello murino immunocompromesso, i costrutti di HA e collagene seminati con MSC umane sono stati valutati per il potenziale ECO in vivo mediante impianto sottocutaneo. I risultati mostrano che gli idrogel di HA sono eccellenti come impalcatura per le MSC per creare innesti di cartilagine artificiale che consentono la formazione ossea attraverso l’ECO.
Il protocollo è diviso in due fasi. In primo luogo, i costrutti di MSC umane seminati su idrogel di acido ialuronico vengono preparati e differenziati in cartilagine ipertrofica in vitro. Successivamente, i costrutti differenziati vengono impiantati per via sottocutanea in un modello nudo per indurre l’ossificazione endocondrale in vivo (Figura 1).
L’utilizzo di materiali per scaffold appropriati che promuovono la transizione dalla cartilagine ipertrofica all’osso è un approccio promettente per aumentare gli innesti di cartilagine ipertrofica ingegnerizzati basati su MSC e trattare difetti ossei di dimensioni clinicamente significative. Qui, mostriamo che l’HA è un eccellente materiale per scaffold per supportare la differenziazione del tessuto cartilagineo ipertrofico basato su MSC in vitro e per promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (KAKENHI) della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (sovvenzione n. JP19K10259 e 22K10032 a MAI).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |