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Biology

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65573
, , ,
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University

Summary

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in vivoでの融合移植片間の血管新生を伴う統合骨の形成に効果的です。

Abstract

間葉系幹細胞(MSC)を用いた従来の骨再生療法は、血管新生を誘導するメカニズムがないため、臨界サイズ以上の骨欠損への適用が困難でした。間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植すると、軟骨内骨化(ECO)を介して in vivo で血管新生と骨形成が誘導されます。したがって、このECOを介したアプローチは、将来的に有望な骨再生療法になる可能性があります。このECOを介したアプローチの臨床応用の重要な側面は、骨欠損を修復するために移植するのに十分な軟骨を準備するためのプロトコルを確立することです。特に、実際の骨欠損の形状に適合するサイズの移植軟骨の単一の塊を設計することは現実的ではありません。そのため、移植する軟骨は、複数個を移植した際に一体的に骨を形成する性質を持っている必要があります。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップして臨床要件を満たすための魅力的なツールである可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、 in vitro でのMSC軟骨形成やin vivoでのECO形成をサポートしますが、臨床応用のニーズを満たす最適な足場材料はまだ決定されていません。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスの重要な成分であり、生分解性で生体適合性の多糖類です。本研究では、HAハイドロゲルが間葉系幹細胞ベースの軟骨組織の in vitro 分化をサポートし、 in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた特性を有することを示しました。

Introduction

自家骨は、外傷、先天性欠損、外科的切除による骨欠損を修復するためのゴールドスタンダードです。しかし、自家骨移植には、ドナーの痛み、感染のリスク、患者から分離できる骨量の制限など、重大な制限があります1,2,3,4。天然または合成ポリマーとリン酸カルシウムやハイドロキシアパタイトなどの鉱化材料を組み合わせた骨代替物として、数多くの生体材料が開発されています5,6。これらの人工材料における骨形成は、通常、幹細胞が膜内骨化(IMO)プロセスを通じて骨芽細胞に直接分化することを可能にするプライミング材料として、石灰化材料を使用して達成される7。このプロセスは血管新生ステップを欠いており、移植後の移植片のin vivo血管新生が不十分であり8,9,10、したがって、そのようなプロセスを使用するアプローチは、大きな骨欠損の治療に最適ではない可能性があります11。

発生中の骨格形成における生来のメカニズムである軟骨内骨化(ECO)プロセスを再現するために適用された戦略は、従来のIMOベースのアプローチに関連する重大な問題を克服することが示されています。ECOでは、軟骨テンプレートの軟骨細胞が血管内皮増殖因子(VEGF)を放出し、血管浸潤と軟骨テンプレートの骨へのリモデリングを促進します12。軟骨リモデリングと血管新生による骨形成へのECOを介したアプローチは、骨折修復中にも活性化され、MSCに由来する人工的に作成された軟骨組織をプライミング材料として使用します。軟骨細胞は、骨欠損の低酸素症に耐え、血管新生を誘導し、血管のない軟骨移植片を血管新生組織に変換することができます。MSCベースの軟骨移植片は、そのようなECOプログラムを実施することにより、in vivoで骨を生成することが多くの研究で報告されています13、14、15、16、17、18、19、20、21。

このECOを介したアプローチの臨床応用に不可欠な要件は、臨床現場で必要な量の軟骨移植片を準備する方法です。実際の骨欠損にフィットするサイズの臨床軟骨を作製することは現実的ではありません。したがって、移植軟骨は、複数の断片が移植されるときに骨を一体的に形成する必要があります22。ハイドロゲルは、軟骨内骨化のための組織工学的移植片をスケールアップするための魅力的なツールとなる可能性があります。多くの天然由来のハイドロゲルは、in vitroでのMSC軟骨形成およびin vivoでのECO形成をサポートします23,24,25,26,27,28,29,30,31,32;しかし、臨床応用の要件を満たすための最適な支持材料は未定のままです。ヒアルロン酸(HA)は、軟骨の細胞外マトリックスに存在する生分解性で生体適合性の多糖類である33。HAはCD44などの表面受容体を介してMSCと相互作用し、軟骨形成分化をサポートします25,26,28,30,31,32,34。さらに、HAスキャフォールドはIMOを介したヒト歯髄幹細胞の骨形成分化を促進し35、コラーゲンと組み合わせたスキャフォールドはECOを介した骨形成を促進する36,37。

ここでは、骨髄由来の成人ヒトMSCを用いたHAハイドロゲルの調製方法と、in vitroでの肥大型軟骨形成およびその後のin vivo軟骨内骨化への使用について紹介する38。我々は、HAの特性を、MSCを用いた骨組織工学に広く適用され、軟骨内骨化のための人工移植片のスケールアップに有用な材料であるコラーゲンの特性と比較した17。免疫不全マウスモデルにおいて、ヒトMSCを播種したHAおよびコラーゲンコンストラクトを皮下移植によりin vivo ECOの可能性について評価しました。その結果、HAハイドロゲルは、間葉系幹細胞がECOによる骨形成を可能にする人工軟骨移植片を作るための足場として優れていることが示されました。

プロトコルは2つのステップに分かれています。まず、ヒアルロン酸ハイドロゲル上に播種されたヒト間葉系幹細胞のコンストラクトを調製し、 in vitroで肥厚軟骨に分化させる。次に、分化した構築物をヌードモデルに皮下移植し、 in vivo で軟骨内骨化を誘導します(図1)。

Protocol

このプロトコルでは、4週齢の雄のヌードマウスを使用します。4匹のマウスをケージに入れ、22〜24°C、相対湿度50%〜70%で12時間の明暗サイクルで飼育します。動物実験は、東京医科歯科大学動物実験委員会が承認したガイドライン(承認ID:A2019-204C、A2020-116A、A2021-121A)に準じて実施しました。 1. 緩衝液および試薬の調製 間葉系幹細胞増殖培地(MSC増殖培?…

Representative Results

MSCを内包したHAハイドロゲルを、軟骨形成の誘導因子であるTGFβ3を添加した軟骨形成培地で培養した41 (ステップ4.1)。我々は、HAの特性を、前述のように、軟骨内骨化のためのMSCベースの人工軟骨移植片の作成に有効であることが示されているコラーゲンの特性と比較した38。未分化MSCは、骨形成分化(すなわち、膜内骨化)によって骨を生成…

Discussion

肥厚軟骨から骨への移行を促進する適切な足場材料を使用することは、MSCベースの人工肥厚軟骨移植片をスケールアップし、臨床的に有意なサイズの骨欠損を治療するための有望なアプローチです。本研究では、HAがin vitroでMSCベースの肥大軟骨組織の分化をサポートし、in vivoで軟骨内骨形成を促進する優れた足場材料であることを示しています38。さらに、<em…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業(科研費)の支援を受けて行われました。JP19K10259と 22K10032 を MAI に変更)。

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332
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References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host’s vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues–the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton’s jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O’Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. . Hydrogels – Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

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Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).
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