Integrert bendannelse gjennom in vivo endokondral ossifikasjon ved bruk av mesenkymale stamceller

Summary

Benterapi via endokondral ossifikasjon ved implantering av kunstig bruskvev produsert fra mesenkymale stamceller har potensial til å omgå ulempene ved konvensjonelle terapier. Hyaluronsyrehydrogeler er effektive for å skalere opp jevnt differensierte brusktransplantater, samt skape integrert bein med vaskularisering mellom smeltede transplantater in vivo.

Abstract

Konvensjonell benregenereringsterapi ved bruk av mesenkymale stamceller (MSC) er vanskelig å anvende på beindefekter større enn den kritiske størrelsen fordi den ikke har en mekanisme for å indusere angiogenese. Implantering av kunstig bruskvev fremstilt fra MSC induserer angiogenese og beindannelse in vivo via endokondral ossifikasjon (ECO). Derfor kan denne økomedierte tilnærmingen være en lovende benregenereringsterapi i fremtiden. Et viktig aspekt ved den kliniske anvendelsen av denne økomedierte tilnærmingen er å etablere en protokoll for å forberede nok brusk til å bli implantert for å reparere beindefekten. Det er spesielt ikke praktisk å designe en enkelt masse podet brusk av en størrelse som samsvarer med formen på den faktiske beindefekten. Derfor må brusken som skal transplanteres ha egenskapen til å danne bein integrert når flere stykker er implantert. Hydrogeler kan være et attraktivt verktøy for å skalere opp vevskonstruerte transplantater for endokondral ossifikasjon for å møte kliniske krav. Selv om mange naturlig avledede hydrogeler støtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo, er det optimale stillasmaterialet for å møte behovene til kliniske applikasjoner ennå ikke bestemt. Hyaluronsyre (HA) er en avgjørende komponent i den ekstracellulære bruskmatriksen og er et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt polysakkarid. Her viser vi at HA-hydrogeler har utmerkede egenskaper for å støtte in vitro differensiering av MSC-basert bruskvev og fremme endokondral beindannelse in vivo.

Introduction

Autolog bein er fortsatt gullstandarden for å reparere beindefekter på grunn av traumer, medfødte defekter og kirurgisk reseksjon. Imidlertid har autogen bentransplantasjon betydelige begrensninger, inkludert donorsmerter, risiko for infeksjon og begrenset benvolum som kan isoleres fra pasientene 1,2,3,4. Tallrike biomaterialer har blitt utviklet som bensubstitutter, som kombinerer naturlige eller syntetiske polymerer med mineraliserte materialer som kalsiumfosfat eller hydroksyapatitt ^5,6. Bendannelse i disse konstruerte materialene oppnås vanligvis ved å bruke det mineraliserte materialet som et primingmateriale for å tillate stamceller å differensiere direkte til osteoblaster gjennom intramembran ossification (IMO) prosess⁷. Denne prosessen mangler det angiogene trinnet, noe som resulterer i utilstrekkelig in vivo vaskularisering av transplantatet etter implantasjon 8,9,10^, og derfor kan tilnærminger som bruker en slik prosess ikke være optimale for behandling av store beindefekter ¹¹.

Strategier anvendt for å rekapitulere endokondral ossifikasjon (ECO) prosess, en medfødt mekanisme i skjelettogenese under utvikling, har vist seg å overvinne betydelige problemer forbundet med tradisjonelle IMO-baserte tilnærminger. I ECO frigjør kondrocytter i bruskmalen vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), som fremmer vaskulær infiltrasjon og remodellering av bruskmalen til bein¹². Den ECO-medierte tilnærmingen til osteogenese via bruskremodellering og angiogenese, som også aktiveres under bruddreparasjon, bruker kunstig opprettet bruskvev avledet fra MSC som et primingmateriale. Kondrocytter kan tolerere hypoksi i beindefekter, indusere angiogenese og konvertere et vaskulært brusktransplantat til angiogent vev. Tallrike studier har rapportert at MSC-baserte brusktransplantater genererer bein in vivo ved å implementere et slikt ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Et viktig krav for den kliniske anvendelsen av denne øko-medierte tilnærmingen er hvordan man forbereder ønsket mengde brusktransplantat i en klinisk setting. Fremstilling av klinisk brusk av en størrelse som passer til selve beindefekten er ikke praktisk. Derfor må graftbrusk danne bein integrert når flere fragmenter implanteres²². Hydrogeler kan være et attraktivt verktøy for å skalere opp vevskonstruerte transplantater for endokondral ossifisering. Mange naturlig utvunnede hydrogeler støtter MSC-bruskdannelse in vitro og ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimale støttematerialet for å oppfylle kravene til klinisk anvendelse er imidlertid ikke bestemt. Hyaluronsyre (HA) er et biologisk nedbrytbart og biokompatibelt polysakkarid tilstede i den ekstracellulære matrisen av brusk³³. HA interagerer med MSC via overflatereseptorer som CD44 for å støtte kondrogen differensiering 25,26,28,30,31,32,34. I tillegg fremmer HA-stillas IMO-mediert osteogen differensiering av humane pulpstamceller³⁵, og stillas kombinert med kollagen fremmer ECO-mediert osteogenese^36,37.

Her presenterer vi en metode for fremstilling av HA-hydrogeler ved bruk av benmargsderiverte voksne humane MSC og deres bruk for hypertrofisk kondrogenese in vitro og påfølgende endokondral ossifikasjon in vivo³⁸. Vi sammenlignet egenskapene til HA med kollagen, et materiale som er mye brukt i beinvevsteknikk med MSC og et nyttig materiale for å skalere opp kunstige transplantater for endokondral ossifikasjon¹⁷. I en immunkompromittert musemodell ble HA- og kollagenkonstruksjoner sådd med humane MSC evaluert for in vivo ECO-potensiale ved subkutan implantasjon. Resultatene viser at HA-hydrogeler er utmerket som stillas for MSC for å lage kunstige brusktransplantater som tillater beindannelse gjennom ECO.

Protokollen er delt inn i to trinn. Først fremstilles konstruksjoner av humane MSC-er sådd på hyaluronhydrogel og differensieres til hypertrofisk brusk in vitro. Deretter implanteres de differensierte konstruksjonene subkutant i en nakenmodell for å indusere endokondral ossifikasjon in vivo (figur 1).

Protocol

Denne protokollen bruker 4 uker gamle mannlige nakne mus. Hus fire mus i et bur under en 12 timers lys / mørk syklus ved 22-24 ° C og 50% -70% relativ fuktighet. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Tokyo Medical and Dental University (godkjennings-ID: A2019-204C, A2020-116A og A2021-121A). 1. Fremstilling av buffere og reagenser Klargjør mesenkymalt stamcellevekstmedium (MSC vekstmed…

Representative Results

MSC-innkapslede HA-hydrogeler ble dyrket i kondrogent medium supplert med TGFβ3, en induktor av kondrogenese41 (trinn 4.1). Vi sammenlignet egenskapene til hyaluronsyre med kollagen, som har vist seg å være effektive for å skape MSC-baserte kunstige brusktransplantater for endokondral ossifikasjon, som beskrevet tidligere38. Udifferensierte MSC-er ble ikke inkludert som negative kontroller i denne studien fordi det har vist seg at udifferensierte MSC-er krever mineralis…

Discussion

Bruk av passende stillasmaterialer som fremmer overgangen fra hypertrofisk brusk til bein, er en lovende tilnærming til å skalere opp MSC-baserte konstruerte hypertrofiske brusktransplantater og behandle beindefekter av klinisk signifikant størrelse. Her viser vi at HA er et utmerket stillasmateriale for å støtte differensiering av MSC-basert hypertrofisk bruskvev in vitro og for å fremme endokondral beindannelse in vivo³⁸. Videre ble in vivo HA-konstruksjoner vist…

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332