Benterapi via endokondral benbildning genom implantation av konstgjord broskvävnad framställd av mesenkymala stamceller har potential att kringgå nackdelarna med konventionella terapier. Hyaluronsyrahydrogeler är effektiva för att skala upp likformigt differentierade brosktransplantat samt skapa integrerat ben med vaskularisering mellan sammansmälta transplantat in vivo.
Konventionell benregenereringsterapi med mesenkymala stamceller (MSC) är svår att tillämpa på bendefekter som är större än den kritiska storleken eftersom den inte har någon mekanism för att inducera angiogenes. Implantation av konstgjord broskvävnad tillverkad från MSC inducerar angiogenes och benbildning in vivo via endokondral ossifiering (ECO). Därför kan detta ECO-medierade tillvägagångssätt vara en lovande benregenereringsterapi i framtiden. En viktig aspekt av den kliniska tillämpningen av detta ECO-medierade tillvägagångssätt är att upprätta ett protokoll för att förbereda tillräckligt med brosk som ska implanteras för att reparera bendefekten. Det är särskilt inte praktiskt att konstruera en enda massa ympat brosk av en storlek som överensstämmer med formen på den faktiska bendefekten. Därför måste brosket som ska transplanteras ha egenskapen att bilda ben integrerat när flera bitar implanteras. Hydrogeler kan vara ett attraktivt verktyg för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat för endokondral benbildning för att möta kliniska krav. Även om många naturligt framställda hydrogeler stöder MSC-broskbildning in vitro och ECO in vivo, har det optimala ställningsmaterialet för att möta behoven i kliniska tillämpningar ännu inte fastställts. Hyaluronsyra (HA) är en avgörande komponent i broskets extracellulära matris och är en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel polysackarid. Här visar vi att HA-hydrogeler har utmärkta egenskaper för att stödja in vitro-differentiering av MSC-baserad broskvävnad och främja endokondral benbildning in vivo.
Autologt ben är fortfarande guldstandarden för att reparera bendefekter på grund av trauma, medfödda defekter och kirurgisk resektion. Autogen bentransplantation har dock betydande begränsningar, inklusive donatorsmärta, infektionsrisk och begränsad benvolym som kan isoleras från patienterna 1,2,3,4. Många biomaterial har utvecklats som bensubstitut och kombinerar naturliga eller syntetiska polymerer med mineraliserade material som kalciumfosfat eller hydroxiapatit 5,6. Benbildning i dessa konstruerade material uppnås vanligtvis med hjälp av det mineraliserade materialet som ett primingmaterial för att tillåta stamceller att differentiera direkt till osteoblaster genom intramembranbenbildningsprocessen(IMO) 7. Denna process saknar det angiogena steget, vilket resulterar i otillräcklig in vivo vaskularisering av transplantatet efter implantation 8,9,10, och därför kan metoder som använder en sådan process inte vara optimala för behandling av stora bendefekter 11.
Strategier som används för att rekapitulera den endokondrala benbildningsprocessen (ECO), en medfödd mekanism i skelettbildningen under utvecklingen, har visat sig övervinna betydande problem i samband med traditionella IMO-baserade metoder. I ECO frigör kondrocyter i broskmallen vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), vilket främjar vaskulär infiltration och ombyggnad av broskmallen till ben12. Det ECO-medierade tillvägagångssättet för osteogenes via broskremodellering och angiogenes, som också aktiveras under frakturreparation, använder artificiellt skapad broskvävnad härledd från MSC som primingmaterial. Kondrocyter kan tolerera hypoxi vid bendefekter, inducera angiogenes och omvandla ett kärlfritt brosktransplantat till angiogen vävnad. Många studier har rapporterat att MSC-baserade brosktransplantat genererar ben in vivo genom att implementera ett sådant ECO-program 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Ett viktigt krav för den kliniska tillämpningen av detta ECO-medierade tillvägagångssätt är hur man förbereder den önskade mängden brosktransplantat i en klinisk miljö. Att förbereda kliniskt brosk av en storlek som passar den faktiska bendefekten är inte praktiskt. Därför måste transplantatbrosk bilda ben integrerat när flera fragment implanteras22. Hydrogeler kan vara ett attraktivt verktyg för att skala upp vävnadskonstruerade transplantat för endokondral benbildning. Många naturligt framställda hydrogeler stöder MSC-broskbildning in vitro och ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Det optimala stödmaterialet för att uppfylla de kliniska tillämpningskraven har dock inte fastställts. Hyaluronsyra (HA) är en biologiskt nedbrytbar och biokompatibel polysackarid som finns i den extracellulära matrisen av brosk33. HA interagerar med MSC via ytreceptorer såsom CD44 för att stödja kondrogen differentiering 25,26,28,30,31,32,34. Dessutom främjar HA-stödstrukturer IMO-medierad osteogen differentiering av mänskliga tandpulpastamceller35, och stödstrukturer i kombination med kollagen främjar ECO-medierad osteogenes36,37.
Här presenterar vi en metod för att framställa HA-hydrogeler med hjälp av benmärgshärledda vuxna humana MSC och deras användning för hypertrofisk kondrogenes in vitro och efterföljande endokondral benbildning in vivo38. Vi jämförde egenskaperna hos HA med kollagen, ett material som används i stor utsträckning inom benvävnadsteknik med MSC och ett användbart material för att skala upp artificiella transplantat för endokondral ossifikation17. I en immunsupprimerad musmodell utvärderades HA- och kollagenkonstruktioner sådda med humana MSC för in vivo ECO-potential genom subkutan implantation. Resultaten visar att HA-hydrogeler är utmärkta som en byggnadsställning för MSC för att skapa konstgjorda brosktransplantat som tillåter benbildning genom ECO.
Protokollet är uppdelat i två steg. Först prepareras konstruktioner av humana MSC sådda på hyaluronanhydrogel och differentieras till hypertrofiskt brosk in vitro. Därefter implanteras de differentierade konstruktionerna subkutant i en nakenmodell för att inducera endokondral benbildning in vivo (Figur 1).
Att använda lämpliga byggnadsmaterial som främjar övergången från hypertrofiskt brosk till ben är ett lovande tillvägagångssätt för att skala upp MSC-baserade konstruerade hypertrofiska brosktransplantat och behandla bendefekter av kliniskt signifikant storlek. Här visar vi att HA är ett utmärkt byggnadsmaterial för att stödja differentieringen av MSC-baserad hypertrofisk broskvävnad in vitro och för att främja endokondral benbildning in vivo38. Dessutom, i…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag för vetenskaplig forskning (KAKENHI) från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (anslagsnummer). JP19K10259 och 22K10032 till MAI).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |