Hyperglykæmisk klemme og hypoglykæmisk klemme hos bevidste mus

Summary

En hyperglykæmisk klemme anvendes til måling af insulinfrigivelse med en opretholdt højere blodglukosekoncentration. En hypoglykæmisk klemme er til måling af glukoseproduktion induceret af modregulerende reaktioner. Begge metoder bruger den samme kirurgiske procedure. Her præsenterer vi en klemmeteknik til vurdering af systemisk glukosemetabolisme.

Abstract

Diabetes mellitus (DM) skyldes utilstrækkelig insulinfrigivelse fra bugspytkirtlen β-celler (Type1 DM) og insulinfølsomhed i muskler, lever og fedtvæv (Type2 DM). Insulininjektion behandler DM-patienter, men fører til hypoglykæmi som en bivirkning. Cortisol og katekolaminer frigives for at aktivere glukoseproduktion fra leveren for at genvinde hypoglykæmi, kaldet modregulerende reaktioner (CRR). I DM-forskning ved hjælp af gnavermodeller anvendes glukosetolerancetest og 2-deoxy-glucoseinjektion til at måle henholdsvis insulinfrigivelse og CRR. Imidlertid ændres blodglukosekoncentrationerne vedvarende under forsøg, hvilket forårsager vanskeligheder med at vurdere netto insulinfrigivelse og CRR. Denne artikel beskriver en metode, hvor blodsukkeret holdes på 250 mg / dL eller 50 mg / dL hos bevidste mus for at sammenligne frigivelsen af henholdsvis insulin og CRR-hormoner.

Polyethylenslanger implanteres i musenes halspulsåre og halsvene, og musene får lov til at komme sig efter operationen. Den jugulære veneslange er forbundet til en Hamilton-sprøjte med en sprøjtepumpe for at muliggøre insulin- eller glukoseinfusion med konstant og variabel hastighed. Den halspulsåre slanger er til blodindsamling. For den hyperglykæmiske klemme infunderes 30% glukose i venen, og blodglukoseniveauerne måles fra arterielt blod hvert 5. minut eller 10 minut. Infusionshastigheden på 30% glucose øges, indtil blodglukoseniveauet bliver 250 mg / dl. Blod indsamles for at måle insulinkoncentrationer. Til hypoglykæmisk klemme infunderes 10 mU / kg / min insulin sammen med 30% glucose, hvis infusionshastighed er variabel for at opretholde 50 mg / dL blodglukoseniveau. Blod indsamles for at måle modregulerende hormoner, når både glukoseinfusion og blodsukker når en stabil tilstand. Både hyperglykæmiske og hypoglykæmiske klemmer har samme kirurgiske procedure og eksperimentelle opsætninger. Denne metode er således nyttig for forskere af systemisk glukosemetabolisme.

Introduction

Glukose er en vigtig energikilde for celler, og mangel på glukose kan føre til en række symptomer og komplikationer. I tilfælde af lav glukose (hypoglykæmi, generelt mindre end 70 mg / dL i fastende blodsukkerniveau, men bør ikke bestemmes af en enkelt værdi¹), omfatter de mest almindelige symptomer svaghed, forvirring, svedtendens og hovedpine. Det kan også forstyrre cerebral funktion og øge risikoen for kardiovaskulære hændelser og dødelighed². Omvendt er hyperglykæmi en medicinsk tilstand, hvor plasmaglucosekoncentrationen overstiger normale niveauer (generelt > 126 mg / dL i fastende blodsukkerniveau³). Dette kan forekomme hos personer med diabetes, der enten har et underskud i insulinproduktion eller udnyttelse. Hyperglykæmi kan føre til diabetisk ketoacidose, som opstår, når kroppen ikke kan bruge glukose til energi, men i stedet nedbryder fedtsyrer til brændstof. Den hyperglykæmiske hyperosmolære tilstand øger også dødeligheden⁴. Langvarig hyperglykæmi kan forårsage skade på blodkar, nerver og organer, hvilket fører til udvikling af flere kroniske komplikationer såsom hjerte-kar-sygdomme, retinopatier og nyresygdomme. Således skal blodglukosekoncentrationen opretholdes i et tæt område mellem 100 mg / dL og 120 mg / dL.

Blodglukose reguleres af balancen mellem glukoseindgang og -output i en model med et rum (figur 1A). Glukoseinput inkluderer absorberet glukose fra mad og glukoseproduktion fra leveren, nyrerne og tyndtarmen. Glukoseproduktion omfatter glukoseoptagelse i væv og glukosebortskaffelse fra nyrerne. Både mængden af glukoseinput og output reguleres af endokrine hormoner. For eksempel frigives glukagon, corticosteron og katekolaminer, kendt som modregulerende hormoner, når blodsukkerniveauet falder⁵. De stimulerer nedbrydningen af glykogen og syntesen af glucose, hovedsageligt fra leveren; Disse processer er kendt som henholdsvis glycogenolyse og glukoneogenese. Hyperglykæmi øger insulinfrigivelsen fra β-celler i bugspytkirtlen og stimulerer glukoseoptagelsen i muskler, fedtvæv og hjerte 6,7,8,9. Motion øger insulinuafhængig glukoseoptagelse¹⁰. Det sympatiske nervesystem øger glukoseoptagelsen i muskler og brunt fedtvæv ^6,11. For at måle evnen til at regulere glukosemetabolismen i perifert væv bruger forskere typisk glukosetolerancetesten (GTT) og insulintolerancetesten (ITT) (figur 1B, C). I GTT skal to faktorer overvejes: insulinfrigivelse og insulinfølsomhed (figur 1B). Imidlertid er glukosekoncentrationskurven under 120 minutters testen forskellig i hver mus, hvilket kan påvirke forskellige mængder hormonfrigivelse. I ITT reguleres blodsukkeret af både insulinfølsomhed og frigivelse af modregulerende hormoner. Derfor er det vanskeligt at bestemme den præcise betydning af glukosemetabolisme, insulinfrigivelse og insulinfølsomhed i GTT og ITT i situationer, hvor blodsukkerniveauet ikke er konstant.

For at overvinde disse problemer er det ønskeligt at holde blodsukkeret på et konstant niveau (eller “klemme”). I hyperglykæmisk klemme infunderes glukose i blodbanen for at hæve blodsukkerniveauet til et bestemt niveau og opretholdes derefter på dette niveau i en periode. Mængden af infunderet glukose justeres baseret på målinger af blodsukkerniveauet hvert 5.-10. minut for at opretholde en stabil tilstand. Denne teknik er især nyttig til forståelse af parametrene for insulinsekretion ved et fastspændt glukoseniveau. Hypoglykæmisk klemme er en metode til at opretholde lave blodsukkerniveauer ved infusion af insulin. Glukose infunderes med variabel hastighed for at opretholde et specifikt blodsukkerniveau. Hvis musen ikke kan komme sig efter hypoglykæmi, skal der infunderes mere glukose.

Selvom der er mange fordele ved at udføre hyperglykæmiske og hypoglykæmiske klemmer, betragtes de kirurgiske og eksperimentelle procedurer som teknisk vanskelige. Således har få forskergrupper været i stand til at gøre dem. Vi havde til formål at beskrive disse metoder for forskere med økonomiske og arbejdsstyrkemæssige begrænsninger til at starte disse eksperimenter med et lavere budget.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Kumamoto University. BEMÆRK: Til smertelindring blev ibuprofen givet i drikkevand (0,11 mg/ml) i 48 timer, og buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg i.p.) blev givet 30 minutter før operationen. Sterile forhold omfatter handsker, masker og autoklaverede instrumenter steriliseret med ethylenoxid mellem dyr. Operationen blev udført på en varmepude indstillet til 37 °C og dækket af en ny laboratoriemåtte til hve…

Representative Results

Det hypoglykæmiske klemmestudie blev udført på C57BL/6N-hanmus (8 uger gamle, mere end 25 g legemsvægt) 3 timer fastende ved forsøgets start (figur 4A,B). Det oprindelige blodsukkerniveau var 136 mg/dl (t = -15 min). Hvis det er mindre end 90 mg / dL, kan det enten skyldes, at operationen ikke gik godt, eller arteriekateteret blev indsat for dybt, eller blodpropper er kommet ind i blodgennemstrømningen. Musens tilstand efter operationen påvirker energimetabolismen i m…

Discussion

Metoden beskrevet her er enkel, der kan gøres med pipettespidser, sprøjter og andre genstande, der findes i almindelige laboratorier. Selvom forskere muligvis skal købe ekstra rør og pumper, er dyrt udstyr ikke nødvendigt. Således er denne protokol for kateterisering og klemme lettere at starte sammenlignet med tidligere rapporter 12,13,14.

Klemmeteknikken blev udviklet omkring 1970 og er blevet…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5