Hepatisk glukoseproduksjon, ureagenese og lipolyse kvantifisert ved hjelp av Perfused Mouse Liver Model

Summary

Her presenterer vi en robust metode for in situ perfusjon av museleveren for å studere akutt og direkte regulering av levermetabolisme uten å forstyrre leverarkitekturen, men i fravær av ekstrahepatiske faktorer.

Abstract

Leveren har mange funksjoner, inkludert næringsstoffskifte. I motsetning til andre in vitro og in vivo modeller av leverforskning, tillater den isolerte perfuserte leveren studiet av leverbiologi og metabolisme i hele leveren med en intakt leverarkitektur, skilt fra påvirkning av ekstrahepatiske faktorer. Leverperfusjoner ble opprinnelig utviklet for rotter, men metoden er også tilpasset mus. Her beskriver vi en protokoll for in situ perfusjon av museleveren. Leveren perfuseres antegradely gjennom portalvenen med oksygenert Krebs-Henseleit bikarbonatbuffer, og utgangen samles fra den suprahepatiske vena cava inferior med klemming av den infrahepatiske dårligere vena cava for å lukke kretsen. Ved hjelp av denne metoden kan de direkte levereffektene av en testforbindelse evalueres med en detaljert tidsoppløsning. Leverfunksjon og levedyktighet er stabil i minst 3 timer, noe som gjør det mulig å inkludere interne kontroller i samme eksperiment. De eksperimentelle mulighetene ved hjelp av denne modellen er mange og kan utlede innsikt i leverfysiologi og leversykdommer.

Introduction

Leveren er et viktig organ i stoffskiftet. Det spiller en nøkkelrolle i kontrollen av energibalansen i hele kroppen ved å regulere glukose-, lipid- og aminosyremetabolismen. Økningen i leversykdommer over hele verden fremstår som en stor global helsebyrde, og det er behov for mer kunnskap om patofysiologien og dens konsekvenser for leverfunksjoner.

Ulike in vitro-modeller er utviklet for forskning på leveren for å komplementere in vivo-studier. Isolerte og dyrkede primære hepatocytter fra gnagere og mennesker er mye brukt. Ikke-parenkymale celler kan separeres fra hepatocytter ved hjelp av differensial- og gradientsentrifugering, og samkulturen av forskjellige celletyper er nyttig for å studere intercellulær crosstalk¹. Selv om primære humane hepatocytter regnes som den gyldne standarden for testing av legemiddeltoksisitet, har flere studier vist at hepatocytter raskt dedifferensierer i vevskultur, noe som resulterer i tap av leverfunksjoner ^2,3,4. Hepatocytkultur i et 3D-sfæroidsystem forbedrer dedifferensieringen, er mer stabil og ser ut til å etterligne leveren in vivo i høyere grad enn de tradisjonelle 2D-kultursystemene⁵. Presisjonskårne leverskiver er en annen veletablert in vitro-modell som holder vevsarkitekturen intakt og inneholder de ikke-parenkymale cellene som er tilstede i leveren⁶. Mer avanserte in vitro-modeller inkluderer lever-on-a-chip⁷ og leverorganoider⁸. Men med alle disse tilnærmingene er det et tap av strukturell integritet og strømningsdynamikk, inkludert vektoriell portal-hepatisk venestrøm, noe som sannsynligvis påvirker generaliserbarheten.

Den isolerte perfuserte rottelever ble først beskrevet av Claude Bernard i 1855⁹, og brukes fortsatt i ulike vitenskapelige felt for studier av leverbiologi, toksikologi og patofysiologi. Fordeler med den perfuserte leveren sammenlignet med de ovennevnte in vitro-modellene inkluderer vedlikehold av leverarkitekturen, vaskulær strømning, hepatocytpolariteten og sonering, og interaksjonene mellom hepatocytter og ikke-parenkymale celler. Sammenlignet med in vivo-studier, tillater den perfuserte leveren studier av levermetabolisme på en isolert måte, unngår ekstrahepatiske faktorer som bæres av blodet og med full kontroll over eksperimentelle forhold. Flere modifikasjoner har blitt gjort for å forbedre rotteleverperfusjonsmodellen gjennom årene^10,11,12,13. Selv om mus har blitt brukt til isolerte perfuserte leverstudier, er mindre litteratur tilgjengelig. Her presenterer vi en metode for in situ perfusjon av museleveren ved kanylering av portalvenen og den suprahepatiske vena cava inferior for å studere de akutte og direkte metabolske responsene på metabolske substrater og hormoner målt i levervenøst avløp fra museleveren i sanntid.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført med tillatelse fra det danske dyreforsøksinspektoratet, Miljø- og matministeriet i Danmark (tillatelse 2018-15-0201-01397), og den lokale etiske komiteen i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU, National Institutes of Health (publikasjon nr. 85-3) og etter retningslinjene i dansk lovgivning for dyreforsøk (1987). Dette er en terminal prosedyre, og dødsårsaken er ekssanguinering og perforering av membranen under dyp anestesi. 1. Forsøksdyr <o…

Representative Results

En jevn grunnlinje er nødvendig for å avgjøre om en stimulus eller substrat fører til frigjøring av molekylet av interesse. Figur 3A viser et eksempel på et vellykket eksperiment. Produksjon av urea i perfusert lever måles i 2 minutters intervaller og vises som gjennomsnitt ± SEM. Basisperiodene forut for hver av de to stimuleringsperiodene er stabile. Gjennomsnittlig ureaproduksjon i de to stimuleringsperiodene og de respektive foregående baselinjen…

Discussion

Den isolerte perfuserte museleveren er et sterkt forskningsverktøy for studier av dynamikken og molekylære mekanismer for levermetabolisme. Muligheten for minutt-til-minutt prøveinnsamling gir en detaljert evaluering av den direkte effekten av en testforbindelse på leveren. Sammenlignet med in vivo-studier, tillater den perfuserte leveren oss å studere levermetabolisme på en isolert måte, unngå ekstrahepatiske faktorer som bæres av blodet og med full kontroll over eksperimentelle forhold. Fordelene ved …