Leverglukosproduktion, ureagenes och lipolys kvantifierad med hjälp av den perfunderade muslevermodellen

Summary

Här presenterar vi en robust metod för in situ perfusion av muslever för att studera den akuta och direkta regleringen av levermetabolismen utan att störa leverarkitekturen men i frånvaro av extrahepatiska faktorer.

Abstract

Levern har många funktioner, bland annat näringsmetabolism. Till skillnad från andra in vitro – och in vivo-modeller för leverforskning möjliggör den isolerade perfunderade levern studier av leverbiologi och metabolism i hela levern med en intakt leverarkitektur, separerad från påverkan av extrahepatiska faktorer. Leverperfusioner utvecklades ursprungligen för råttor, men metoden har anpassats även till möss. Här beskriver vi ett protokoll för in situ-perfusion av muslevern. Levern perfunderas antegradivt genom portvenen med syresatt Krebs-Henseleit bikarbonatbuffert, och utflödet samlas upp från den suprahepatiska nedre hålvenen med fastspänning av den infrahepatiska nedre hålvenen för att sluta kretsloppet. Med hjälp av denna metod kan de direkta effekterna i levern av en testförening utvärderas med en detaljerad tidsupplösning. Leverfunktionen och livsdugligheten är stabila i minst 3 timmar, vilket gör det möjligt att inkludera interna kontroller i samma experiment. De experimentella möjligheterna med denna modell är många och kan ge insikt i leverfysiologi och leversjukdomar.

Introduction

Levern är ett viktigt organ i ämnesomsättningen. Det spelar en nyckelroll i kontrollen av hela kroppens energibalans genom att reglera glukos-, lipid- och aminosyrametabolismen. Ökningen av leversjukdomar världen över framstår som en stor global hälsobörda, och mer kunskap behövs om patofysiologin och dess konsekvenser för leverfunktioner.

Olika in vitro-modeller har utvecklats för forskning på levern för att komplettera in vivo-studier. Isolerade och odlade primära hepatocyter från gnagare och människor används i stor utsträckning. Icke-parenkymala celler kan separeras från hepatocyter med hjälp av differentiell och gradient -centrifugering, och samodling av olika celltyper är användbar för att studera intercellulär överhörning¹. Även om primära humana hepatocyter anses vara den gyllene standarden för att testa läkemedelstoxicitet, har flera studier visat att hepatocyterna snabbt dedifferentieras i vävnadsodling vilket resulterar i förlust av leverfunktioner ^2,3,4. Hepatocytodling i ett 3D-sfäroidsystem förbättrar dedifferentieringen, är mer stabil och verkar efterlikna levern in vivo i högre grad än de traditionella 2D-odlingssystemen⁵. Precisionsskurna leverskivor är en annan väletablerad in vitro-modell som håller vävnadsarkitekturen intakt och innehåller de icke-parenkymala cellerna som finns i levern⁶. Mer avancerade in vitro-modeller inkluderar lever-on-a-chip⁷ och leverorganoider⁸. Men med alla dessa tillvägagångssätt finns det en förlust av strukturell integritet och flödesdynamik, inklusive vektoriellt portal-hepatiskt venflöde, vilket sannolikt påverkar generaliserbarheten.

Den isolerade perfunderade råttlevern beskrevs första gången av Claude Bernard¹⁸⁵⁵⁹ och används fortfarande inom olika vetenskapliga områden för studier av leverbiologi, toxikologi och patofysiologi. Fördelarna med den perfunderade levern jämfört med de ovan nämnda in vitro-modellerna inkluderar upprätthållandet av leverarkitekturen, det vaskulära flödet, hepatocyternas polaritet och zonering samt interaktionerna mellan hepatocyter och icke-parenkymala celler. Jämfört med in vivo-studier gör den perfunderade levern det möjligt att studera levermetabolismen på ett isolerat sätt genom att undvika extrahepatiska faktorer som bärs av blodet och med fullständig kontroll över de experimentella förhållandena. Flera modifieringar har gjorts för att förbättra råttleverperfusionsmodellen under åren^10,11,12,13. Även om möss har använts för isolerade perfunderade leverstudier finns mindre litteratur tillgänglig. Här presenterar vi en metod för in situ perfusion av muslevern genom kanylering av portvenen och den suprahepatiska vena cava inferior för att studera de akuta och direkta metabola svaren på metabola substrat och hormoner mätt i levervenöst levervatten från muslever i realtid.

Protocol

Alla djurförsök har utförts med tillstånd från Djurförsöksinspektionen, Danmarks miljö- och livsmedelsministerium (tillstånd 2018-15-0201-01397) och den lokala etiska kommittén i enlighet med EU-direktivet 2010/63/EU, National Institutes of Health (publikation nr 85-3) och enligt riktlinjerna i dansk lagstiftning om djurförsök (1987). Detta är ett terminalt ingrepp, och dödsorsaken är blodförgiftning och perforering av diafragman under djup anestesi. 1. Försöksdjur</str…

Representative Results

En stadig baslinje krävs för att avgöra om en stimulans eller ett substrat leder till frisättning av molekylen av intresse. Figur 3A visar ett exempel på ett lyckat experiment. Produktionen av urea i den perfunderade levern mäts i 2 minuters intervaller och visas som medelvärde ± SEM. Baslinjeperioderna som föregår var och en av de två stimuleringsperioderna är stabila. Den genomsnittliga ureaproduktionen under de två stimuleringsperioderna och d…

Discussion

Den isolerade perfunderade muslevern är ett starkt forskningsverktyg för studier av dynamiken och de molekylära mekanismerna i levermetabolismen. Möjligheten att samla in prover minut för minut ger en detaljerad utvärdering av den direkta effekten av en testförening på levern. Jämfört med in vivo-studier gör den perfunderade levern det möjligt för oss att studera levermetabolismen på ett isolerat sätt och undvika extrahepatiska faktorer som bärs av blodet och med fullständig kontroll över de ex…