Этот протокол описывает in vitro модель некротизирующего энтероколита (НЭК), которая может быть использована для механистических исследований патогенеза заболевания. Он представляет собой микрофлюидный чип, засеянный кишечными энтероидами, полученными из кишечника новорожденного человека, эндотелиальными клетками и кишечным микробиомом новорожденного с тяжелой формой НЭК.
Некротизирующий энтероколит (НЭК) является тяжелым и потенциально смертельным заболеванием кишечника, которое трудно изучать из-за его сложного патогенеза, который остается до конца изученным. Патофизиология НЭК включает нарушение плотных соединений кишечника, повышенную проницаемость кишечного барьера, гибель эпителиальных клеток, микробный дисбиоз и нарушение регуляции воспаления. Традиционные инструменты для изучения НЭК включают животные модели, клеточные линии и органоиды кишечника человека или мыши. Несмотря на то, что исследования с использованием этих модельных систем улучшили понимание патофизиологии заболеваний, их способность повторить сложность НЭК человека ограничена. В настоящее время разработана улучшенная модель NEC in vitro с использованием микрофлюидной технологии, получившая название NEC-on-a-chip. Модель NEC-on-a-chip состоит из микрофлюидного устройства, засеянного кишечными энтероидами, полученными от недоношенного новорожденного, культивируемым совместно с эндотелиальными клетками человека и микробиомом младенца с тяжелой формой НЭК. Эта модель является ценным инструментом для механистических исследований патофизиологии НЭК и новым ресурсом для тестирования на открытие лекарств для лечения кишечных заболеваний новорожденных. В данной рукописи будет приведено подробное описание модели NEC-on-a-chip.
Некротизирующий энтероколит (НЭК) поражает недоношенных новорожденных с частотой до 10% у рожденных с массой тела < 1500г1. Патофизиология НЭК является комплексной и включает повреждение кишечного эпителия, нарушение плотных соединений кишечника, повышение проницаемости кишечного барьера, иммунную дисрегуляцию и гибель эпителиальных клеток 2,3. Наше понимание механизмов, участвующих в патогенезе НЭК, остается неполным, и, несмотря на десятилетия исследований, до сих пор не существует эффективных таргетных методов лечения.
Существенным препятствием для продвижения исследований NEC является ограниченная доступность и малый размер первичной кишечной ткани, выделенной у младенцев. Кишечная ткань, резецированная у младенцев с НЭК, часто некротизирована и сильно повреждена, что затрудняет изучение механизмов, предшествующих началу заболевания. Например, тонкая кишка младенцев с НЭК наводнена иммунными клетками, а также наблюдается снижение количества кишечных стволовых клеток, снижение пролиферации эпителиальных клеток и повышение апоптоза эпителиальных клеток 4,5,6,7. Это приводит к трудностям в культивировании эпителиальных клеток кишечника из этих образцов и в выделении РНК и белков, которые могут разрушаться в этой враждебной воспалительной среде. Кроме того, поскольку у младенцев с хирургическим НЭК патологический процесс уже запущен, механистические исследования факторов, вызывающих заболевание, невозможны. Эти ограничения привели к тому, что для механистических исследований НЭК стали полагаться на животные модели.
Животные модели НЭК были созданы для мышей, крыс, поросят, кроликов и бабуинов 5,8,9,11. Сильной стороной животных моделей является то, что НЭК-подобное заболевание кишечника индуцируется факторами, связанными с возникновением НЭК у людей, включая дисбиотический микробиом, повторяющиеся эпизоды гипоксии и отсутствие грудного молока 5,8,10,11. Кроме того, воспалительная реакция и патологические изменения, наблюдаемые при экспериментальном НЭК, параллельны заболеваниям человека 5,9,12. Несмотря на то, что эти модели имитируют многие особенности НЭК человека, существуют неотъемлемые различия между патофизиологией НЭК у животных и человека. Например, мышиная модель НЭК индуцируется у мышей, родившихся доношенными, и хотя их развитие кишечника является неполным, патофизиология НЭК по своей сути отличается в этом клиническом контексте. Экспрессия генов кишечника мышей при рождении аналогична экспрессии преджизнеспособного человеческого плода и не приближается к экспрессии генов недоношенного новорожденного на сроке 22-24 недели гестации до 14-го дня (P14)13. Это опровергает мышиную модель NEC, потому что повреждение кишечника, как правило, не может быть индуцировано у мышей после P10. Кроме того, инбредным линиям мышей не хватает иммунологического14 и микробиологического разнообразия новорожденныхчеловека15, что служит еще одним осложняющим фактором. Таким образом, более широкое включение первичных образцов человека в исследования NEC повышает клиническую значимость исследований в этой области.
В исследованиях механизмов НЭК in vitro традиционно использовались монотипические клеточные линии, полученные из взрослых клеток рака кишечника, такихкак клетки колоректальной аденокарциномы (Caco2) и аденокарциномы толстой кишки человека (HT-29). Эти модели удобны, но ограничены в физиологической значимости из-за их роста из взрослых раковых клеток, неполяризованной архитектуры и фенотипических изменений, связанных с повторными пассажами в культуре. Кишечные энтероиды улучшают эти модели, поскольку они могут быть выращены из крипт кишечной ткани, дифференцированы во все подтипы кишечного эпителия и образуют трехмерную (3D) ворсинчатую структуру17,18,19,20. Недавно кишечные энтероиды были объединены с микрофлюидной технологией для разработки модели тонкой кишки на чипе и создания более физиологически значимой модельной системы in vitro 21.
Первые микрофлюидные устройства типа «орган-на-чипе» были представлены в начале 2000-х годов22,23,24. Первой моделью органа-на-чипе было дышащее человеческое легкое на чипе25. За этим последовали многочисленные модели одного органа, такие как кишечник 21, печень 26, почки 27, костный мозг 28, гематоэнцефалический барьер 29 и сердце30. Эти модели «орган-на-чипе» использовались для изучения острых, хронических и редких заболеваний, включая острый лучевой синдром31, хроническую обструктивную болезнь легких32 и нейродегенеративные заболевания33. Поляризованный характер клеток на этих чипах и наличие двух клеточных компартментов, разделенных пористой мембраной, позволяет моделировать сложные физиологические процессы, такие как перфузия, градиенты химической концентрации и хемотаксис иммунных клеток34,35. Таким образом, эти микрофлюидные системы предоставляют новый инструмент для изучения патофизиологии и механизмов заболеваний человека.
Модель тонкой кишки на чипе была описана Kasendra et al. в 2018 г., которые использовали педиатрические (в возрасте 10-14 лет) образцы биопсии тонкой кишки, дифференцированные в энтероиды и культивируемые на микрофлюидном устройстве21. Эндотелиальные клетки сосудов, непрерывный поток среды и растяжение/расслабление также были включены в эту модель. Они наблюдали дифференцировку подтипа кишечного эпителия, формирование 3D-ворсинчатых осей, продукцию слизи и паттерны экспрессии генов в тонком кишечнике21. Эта микрофлюидная модель была применена к неонатальным заболеваниям с разработкой системы NEC-on-a-chip, которая включает в себя неонатальные кишечные энтероиды, эндотелиальные клетки и микробиом новорожденного с NEC36. NEC-on-a-chip повторяет многие критические особенности NEC человека, включая экспрессию воспалительных генов, потерю специализированных эпителиальных клеток и снижение барьерной функции кишечника36. Таким образом, эта модель имеет множество применений при изучении НЭК, включая механистические исследования и открытие лекарств. В данной рукописи представлен подробный протокол работы модели NEC-on-a-chip.
Эта система NEC-on-a-chip является новым мощным инструментом, который может быть использован для моделирования патофизиологии NEC. Эта платформа обеспечивает сложную микросреду, которая более близка к кишечной среде in vivo , чем предыдущие модели, за счет включения системы кокультивирован…
The authors have nothing to disclose.
Эта рукопись была поддержана R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) и R01HD105301 (MG) из Национальных институтов здравоохранения, грантом Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), премией Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), грантом UNC Children’s Development Early Career Investigator Grant (LCF) благодаря щедрой поддержке доноров Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, и кафедра педиатрии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл.
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
Chip Cradle | Emulate | N/A | |
Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
SB 431542 | Tocris | 1614 | |
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | |
Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |