Mikrofluidisk modell av nekrotiserende enterokolitt som inneholder humane neonatale intestinale enteroider og et dysbiotisk mikrobiom

Summary

Denne protokollen beskriver en in vitro-modell for nekrotiserende enterokolitt (NEC), som kan brukes til mekanistiske studier av sykdomspatogenese. Den har en mikrofluidisk chip frøet med intestinale enteroider avledet fra den menneskelige neonataltarmen, endotelceller og tarmmikrobiomet til en nyfødt med alvorlig NEC.

Abstract

Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en alvorlig og potensielt dødelig tarmsykdom som har vært vanskelig å studere på grunn av sin komplekse patogenese, som fortsatt er ufullstendig forstått. Patofysiologien til NEC inkluderer forstyrrelse av tarmtette veikryss, økt permeabilitet av tarmbarrieren, epitelcelledød, mikrobiell dysbiose og dysregulert betennelse. Tradisjonelle verktøy for å studere NEC inkluderer dyremodeller, cellelinjer og tarmorganoider fra mennesker eller mus. Mens studier ved hjelp av disse modellsystemene har forbedret feltets forståelse av sykdomspatofysiologi, er deres evne til å rekapitulere kompleksiteten til menneskelig NEC begrenset. En forbedret in vitro-modell av NEC ved hjelp av mikrofluidisk teknologi, kalt NEC-on-a-chip, er nå utviklet. NEC-on-a-chip-modellen består av en mikrofluidisk enhet frøet med intestinale enteroider avledet fra et for tidlig nyfødt, dyrket sammen med humane endotelceller og mikrobiomet fra et spedbarn med alvorlig NEC. Denne modellen er et verdifullt verktøy for mekanistiske studier i patofysiologien til NEC og en ny ressurs for testing av legemiddelforskning for neonatale tarmsykdommer. I dette manuskriptet vil en detaljert beskrivelse av NEC-on-a-chip-modellen bli gitt.

Introduction

Nekrotiserende enterokolitt (NEC) påvirker premature spedbarn, med en forekomst på opptil 10% hos de fødte som veier < 1500 g¹. Patofysiologien til NEC er kompleks og inkluderer skade på tarmepitelet, forstyrrelse av tarmtette kryss, økt tarmbarrierepermeabilitet, immundysregulering og epitelcelledød ^2,3. Vår forståelse av mekanismene involvert i patogenesen av NEC er fortsatt ufullstendig, og til tross for flere tiår med forskning, er det fortsatt ingen effektive målrettede terapier.

En betydelig barriere for å fremme NEC-forskning er den begrensede tilgjengeligheten og den lille størrelsen på primært tarmvev isolert fra menneskelige spedbarn. Tarmvev resektert fra spedbarn med NEC er ofte nekrotisk og alvorlig skadet, noe som kompliserer studier av mekanismer som går forut for sykdomsutbrudd. For eksempel er tynntarmen hos spedbarn med NEC oversvømt med immunceller, og et redusert antall intestinale stamceller, redusert epitelcelleproliferasjon og økt epitelcelleapoptose observeres også 4,5,6,7. Dette fører til vanskeligheter med å dyrke tarmepitelceller fra disse prøvene og isolere RNA og proteiner, som kan nedbrytes i dette fiendtlige inflammatoriske miljøet. I tillegg, siden sykdomsprosessen allerede er avansert hos spedbarn med kirurgisk NEC, er mekanistiske studier av faktorer som induserer sykdom umulige. Disse begrensningene har ført til en avhengighet av dyremodeller for mekanistiske studier av NEC.

Dyremodeller av NEC er etablert for mus, rotter, grisunger, kaniner og bavianer 5,8,9,11. En styrke ved dyremodeller er at NEC-lignende tarmsykdom induseres av faktorer assosiert med NEC-utbrudd hos mennesker, inkludert et dysbiotisk mikrobiom, gjentatte episoder av hypoksi og fraværet av morsmelk gir 5,8,10,11. I tillegg observerte inflammatorisk respons og patologiske endringer under eksperimentell NEC parallell menneskelig sykdom ^5,9,12. Selv om disse modellene etterligner mange av egenskapene til human NEC, er det iboende forskjeller mellom patofysiologien til NEC hos dyr og mennesker. For eksempel er murinmodellen til NEC indusert hos mus født på full sikt, og selv om deres tarmutvikling er ufullstendig, er patofysiologien til NEC iboende forskjellig i denne kliniske sammenhengen. Murine intestinal genuttrykk ved fødselen ligner på et pre-levedyktig humant foster og tilnærmer seg ikke det for et for tidlig nyfødt barn på 22-24 ukers svangerskap før dag 14 (P14) ¹³. Dette forvirrer murine NEC-modellen fordi tarmskade generelt ikke kan induseres hos mus etter P10. I tillegg mangler innavlede stammer av mus det immunologiske¹⁴ og mikrobiologiske mangfoldet av menneskelige nyfødte¹⁵, noe som tjener som en annen forvirrende faktor. Dermed forbedrer økt inkorporering av primære humane prøver i NEC-forskning den kliniske relevansen av studier på dette feltet.

Studier av mekanismene til NEC in vitro har tradisjonelt benyttet monotypiske cellelinjer avledet fra voksne tarmkreftceller, slik som kolorektalt adenokarsinom (Caco2) og humant adenokarsinom (HT-29) celler¹⁶. Disse modellene er praktiske, men begrenset i fysiologisk relevans på grunn av deres vekst fra voksne kreftceller, ikke-polarisert arkitektur og fenotypiske endringer relatert til gjentatte passasjer i kultur. Intestinale enteroider forbedrer disse modellene siden de kan dyrkes fra kryptene i tarmvev, differensiert i alle tarmepitelundertyper, og danner en tredimensjonal (3D) villus-lignende struktur^17,18,19,20. Nylig har intestinale enteroider blitt kombinert med mikrofluidisk teknologi for å utvikle en tynntarm-on-a-chip-modell og gi et mer fysiologisk relevant in vitro modellsystem²¹.

De første organ-on-a-chip mikrofluidiske enhetene ble introdusert tidlig på 2000-tallet^22,23,24. Den første organ-on-a-chip-modellen var den menneskelige pustende lung-on-a-chip²⁵. Dette ble fulgt av mange enkeltorganmodeller som tarm 21, lever 26, nyrer 27, benmarg 28, blod-hjernebarriere ²⁹ og hjerte³⁰. Disse organ-on-a-chip-modellene har blitt brukt til å studere akutte, kroniske og sjeldne sykdommer, inkludert akutt strålingssyndrom,31 kronisk obstruktiv lungesykdom,32 og nevrodegenerative sykdommer ³³. Den polariserte naturen til cellene på disse sjetongene og tilstedeværelsen av to cellulære rom adskilt av en porøs membran muliggjør modellering av komplekse fysiologiske prosesser som perfusjon, kjemiske konsentrasjonsgradienter og immuncellekjemotaksis^34,35. Disse mikrofluidiske systemene gir dermed et nytt verktøy for å studere patofysiologien og mekanismene til menneskelig sykdom.

Tynntarm-on-a-chip-modellen ble beskrevet av Kasendra et al. i 2018, som benyttet pediatriske (alder 10-14 år) små tarmbiopsiprøver differensiert i enteroider og dyrket på en mikrofluidisk enhet²¹. Vaskulære endotelceller, kontinuerlig mediestrøm og strekk/avslapning ble også innlemmet i denne modellen. De observerte intestinale epitelsubtypedifferensiering, dannelse av 3D-villuslignende akser, slimproduksjon og små tarmgenuttrykksmønstre²¹. Denne mikrofluidiske modellen ble brukt på neonatal sykdom med utviklingen av NEC-on-a-chip-systemet, som inkorporerer neonatale intestinale enteroider, endotelceller og mikrobiomet fra en nyfødt med NEC³⁶. NEC-on-a-chip rekapitulerer mange av de kritiske egenskapene til human NEC, inkludert inflammatorisk genuttrykk, tap av spesialiserte epitelceller og redusert tarmbarrierefunksjon³⁶. Dermed har denne modellen mange anvendelser i studiet av NEC, inkludert mekanistiske studier og narkotikaforskning. I dette manuskriptet er det gitt en detaljert protokoll for ytelsen til NEC-on-a-chip-modellen.

Protocol

Enteroider ble avledet fra små tarmprøver fra premature spedbarn (født ved 22 til 36 ukers svangerskap) oppnådd på tidspunktet for kirurgi for NEC eller andre intestinale tilstander med ikke-inflammatoriske etiologier. All prøveinnsamling og behandling ble utført etter informert samtykke og godkjenning fra Institutional Review Boards ved Washington University i St. Louis (IRB-protokollnummer 201706182 og 201804040) og University of North Carolina at Chapel Hill (IRB-protokollnummer 21-3134). <p class="jove_tit…

Representative Results

Enteroider ble sådd på den mikrofluidiske enheten (figur 1) og dyrket som beskrevet ovenfor. Vekst av enteroidene i cellekulturmatrikshydrogel før såing og deretter den påfølgende utvidelsen av tarmepitelcellemonolaget etter såing av enheten ble overvåket via lysfeltmikroskopi (figur 2). Et konfluent monolag fra tarmepitelceller dannet og utviklet seg deretter til en moden 3D-villuslignende struktur (figur 2). Denne mikroflu…

Discussion

Dette NEC-on-a-chip-systemet er et kraftig nytt verktøy som kan brukes til å modellere patofysiologien til NEC. Denne plattformen gir et komplekst mikromiljø som ligner mer på in vivo tarmmiljøet enn tidligere modeller ved å inkorporere et samkultursystem med kontinuerlig luminal strømning og strekk. Disse forholdene fremmer utviklingen av 3D villus-lignende arkitektur omgitt av et svært polarisert epitel bestående av modne epitelundertyper og tette kryss (figur 2) <sup cla…

Materials

[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	Agilent	7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro	BrandTech	759085D
Cell Recovery Solution	Corning	354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	12011319
Chip Cradle	Emulate	N/A
Chip-S1 Stretchable Chip	Emulate	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well	Corning	3548
Collagen from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II automated cell counter	Invitrogen	AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7132	Permeability dye
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 surface activation reagent	Emulate	ER-1	Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent	Emulate	ER-2	Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm	Fisher Scientific	FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
Gentamicin	Gibco	15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Invitrogen	H3570
Human Collagen Type I	Sigma-Aldrich	CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Biologics	H-6054
Inverted Microscope	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller	Supelco	L3027
L-WRN Cells	American Type Culture Collection	CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-274200
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 Hub Module	Emulate	N/A
Paraformaldehyde	ThermoFisher	047392.9L
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod Portable Module	Emulate	N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit	QIAGEN	205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	Corning	431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um	Fisher Scientific	22-363-548
Sterile Syringes, 10mL	Fisher Scientific	14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors	Miltex Instruments	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Detergent
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 Culture Module	Emulate	N/A