Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mikrofluidisk modell av nekrotiserende enterokolitt som inneholder humane neonatale intestinale enteroider og et dysbiotisk mikrobiom

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en in vitro-modell for nekrotiserende enterokolitt (NEC), som kan brukes til mekanistiske studier av sykdomspatogenese. Den har en mikrofluidisk chip frøet med intestinale enteroider avledet fra den menneskelige neonataltarmen, endotelceller og tarmmikrobiomet til en nyfødt med alvorlig NEC.

Abstract

Nekrotiserende enterokolitt (NEC) er en alvorlig og potensielt dødelig tarmsykdom som har vært vanskelig å studere på grunn av sin komplekse patogenese, som fortsatt er ufullstendig forstått. Patofysiologien til NEC inkluderer forstyrrelse av tarmtette veikryss, økt permeabilitet av tarmbarrieren, epitelcelledød, mikrobiell dysbiose og dysregulert betennelse. Tradisjonelle verktøy for å studere NEC inkluderer dyremodeller, cellelinjer og tarmorganoider fra mennesker eller mus. Mens studier ved hjelp av disse modellsystemene har forbedret feltets forståelse av sykdomspatofysiologi, er deres evne til å rekapitulere kompleksiteten til menneskelig NEC begrenset. En forbedret in vitro-modell av NEC ved hjelp av mikrofluidisk teknologi, kalt NEC-on-a-chip, er nå utviklet. NEC-on-a-chip-modellen består av en mikrofluidisk enhet frøet med intestinale enteroider avledet fra et for tidlig nyfødt, dyrket sammen med humane endotelceller og mikrobiomet fra et spedbarn med alvorlig NEC. Denne modellen er et verdifullt verktøy for mekanistiske studier i patofysiologien til NEC og en ny ressurs for testing av legemiddelforskning for neonatale tarmsykdommer. I dette manuskriptet vil en detaljert beskrivelse av NEC-on-a-chip-modellen bli gitt.

Introduction

Nekrotiserende enterokolitt (NEC) påvirker premature spedbarn, med en forekomst på opptil 10% hos de fødte som veier < 1500 g1. Patofysiologien til NEC er kompleks og inkluderer skade på tarmepitelet, forstyrrelse av tarmtette kryss, økt tarmbarrierepermeabilitet, immundysregulering og epitelcelledød 2,3. Vår forståelse av mekanismene involvert i patogenesen av NEC er fortsatt ufullstendig, og til tross for flere tiår med forskning, er det fortsatt ingen effektive målrettede terapier.

En betydelig barriere for å fremme NEC-forskning er den begrensede tilgjengeligheten og den lille størrelsen på primært tarmvev isolert fra menneskelige spedbarn. Tarmvev resektert fra spedbarn med NEC er ofte nekrotisk og alvorlig skadet, noe som kompliserer studier av mekanismer som går forut for sykdomsutbrudd. For eksempel er tynntarmen hos spedbarn med NEC oversvømt med immunceller, og et redusert antall intestinale stamceller, redusert epitelcelleproliferasjon og økt epitelcelleapoptose observeres også 4,5,6,7. Dette fører til vanskeligheter med å dyrke tarmepitelceller fra disse prøvene og isolere RNA og proteiner, som kan nedbrytes i dette fiendtlige inflammatoriske miljøet. I tillegg, siden sykdomsprosessen allerede er avansert hos spedbarn med kirurgisk NEC, er mekanistiske studier av faktorer som induserer sykdom umulige. Disse begrensningene har ført til en avhengighet av dyremodeller for mekanistiske studier av NEC.

Dyremodeller av NEC er etablert for mus, rotter, grisunger, kaniner og bavianer 5,8,9,11. En styrke ved dyremodeller er at NEC-lignende tarmsykdom induseres av faktorer assosiert med NEC-utbrudd hos mennesker, inkludert et dysbiotisk mikrobiom, gjentatte episoder av hypoksi og fraværet av morsmelk gir 5,8,10,11. I tillegg observerte inflammatorisk respons og patologiske endringer under eksperimentell NEC parallell menneskelig sykdom 5,9,12. Selv om disse modellene etterligner mange av egenskapene til human NEC, er det iboende forskjeller mellom patofysiologien til NEC hos dyr og mennesker. For eksempel er murinmodellen til NEC indusert hos mus født på full sikt, og selv om deres tarmutvikling er ufullstendig, er patofysiologien til NEC iboende forskjellig i denne kliniske sammenhengen. Murine intestinal genuttrykk ved fødselen ligner på et pre-levedyktig humant foster og tilnærmer seg ikke det for et for tidlig nyfødt barn på 22-24 ukers svangerskap før dag 14 (P14) 13. Dette forvirrer murine NEC-modellen fordi tarmskade generelt ikke kan induseres hos mus etter P10. I tillegg mangler innavlede stammer av mus det immunologiske14 og mikrobiologiske mangfoldet av menneskelige nyfødte15, noe som tjener som en annen forvirrende faktor. Dermed forbedrer økt inkorporering av primære humane prøver i NEC-forskning den kliniske relevansen av studier på dette feltet.

Studier av mekanismene til NEC in vitro har tradisjonelt benyttet monotypiske cellelinjer avledet fra voksne tarmkreftceller, slik som kolorektalt adenokarsinom (Caco2) og humant adenokarsinom (HT-29) celler16. Disse modellene er praktiske, men begrenset i fysiologisk relevans på grunn av deres vekst fra voksne kreftceller, ikke-polarisert arkitektur og fenotypiske endringer relatert til gjentatte passasjer i kultur. Intestinale enteroider forbedrer disse modellene siden de kan dyrkes fra kryptene i tarmvev, differensiert i alle tarmepitelundertyper, og danner en tredimensjonal (3D) villus-lignende struktur17,18,19,20. Nylig har intestinale enteroider blitt kombinert med mikrofluidisk teknologi for å utvikle en tynntarm-on-a-chip-modell og gi et mer fysiologisk relevant in vitro modellsystem21.

De første organ-on-a-chip mikrofluidiske enhetene ble introdusert tidlig på 2000-tallet22,23,24. Den første organ-on-a-chip-modellen var den menneskelige pustende lung-on-a-chip25. Dette ble fulgt av mange enkeltorganmodeller som tarm 21, lever 26, nyrer 27, benmarg 28, blod-hjernebarriere 29 og hjerte30. Disse organ-on-a-chip-modellene har blitt brukt til å studere akutte, kroniske og sjeldne sykdommer, inkludert akutt strålingssyndrom,31 kronisk obstruktiv lungesykdom,32 og nevrodegenerative sykdommer 33. Den polariserte naturen til cellene på disse sjetongene og tilstedeværelsen av to cellulære rom adskilt av en porøs membran muliggjør modellering av komplekse fysiologiske prosesser som perfusjon, kjemiske konsentrasjonsgradienter og immuncellekjemotaksis34,35. Disse mikrofluidiske systemene gir dermed et nytt verktøy for å studere patofysiologien og mekanismene til menneskelig sykdom.

Tynntarm-on-a-chip-modellen ble beskrevet av Kasendra et al. i 2018, som benyttet pediatriske (alder 10-14 år) små tarmbiopsiprøver differensiert i enteroider og dyrket på en mikrofluidisk enhet21. Vaskulære endotelceller, kontinuerlig mediestrøm og strekk/avslapning ble også innlemmet i denne modellen. De observerte intestinale epitelsubtypedifferensiering, dannelse av 3D-villuslignende akser, slimproduksjon og små tarmgenuttrykksmønstre21. Denne mikrofluidiske modellen ble brukt på neonatal sykdom med utviklingen av NEC-on-a-chip-systemet, som inkorporerer neonatale intestinale enteroider, endotelceller og mikrobiomet fra en nyfødt med NEC36. NEC-on-a-chip rekapitulerer mange av de kritiske egenskapene til human NEC, inkludert inflammatorisk genuttrykk, tap av spesialiserte epitelceller og redusert tarmbarrierefunksjon36. Dermed har denne modellen mange anvendelser i studiet av NEC, inkludert mekanistiske studier og narkotikaforskning. I dette manuskriptet er det gitt en detaljert protokoll for ytelsen til NEC-on-a-chip-modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enteroider ble avledet fra små tarmprøver fra premature spedbarn (født ved 22 til 36 ukers svangerskap) oppnådd på tidspunktet for kirurgi for NEC eller andre intestinale tilstander med ikke-inflammatoriske etiologier. All prøveinnsamling og behandling ble utført etter informert samtykke og godkjenning fra Institutional Review Boards ved Washington University i St. Louis (IRB-protokollnummer 201706182 og 201804040) og University of North Carolina at Chapel Hill (IRB-protokollnummer 21-3134).

1. Isolering og plating av krypter fra human neonatal tynntarm for å etablere enteroider

  1. Media forberedelse
    1. Forbered alle medier som kreves som beskrevet i tabell 1. Sørg for at aseptisk teknikk brukes til fremstilling av alle medier. Filtrer steriliseringsmediet med et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C til bruk.
  2. Vasking og hakking av tarmvev
    1. Plasser cellekulturmatrisehydrogelen på is for å tine. Hent humant tarmvev fra operasjonen. Plasser prøven umiddelbart i 5 ml iskaldt vaskemedium for vev for å inaktivere endogene proteaser.
    2. Skyll tarminnholdet med iskaldt Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS) ved hjelp av en 10 ml sprøyte utstyrt med en trimmet P1000 pipettespiss. Overfør tarmvevet til en 35 mm tallerken som inneholder 5 ml iskald D-PBS.
    3. Klipp tarmvevet i lengderetningen for å eksponere lumen, og kutt det i små biter med fin saks. Skyll tarmvev ved forsiktig omrøring i D-PBS i vevskulturskålen.
    4. Overfør vevfragmenter til en ren 35 mm tallerken. Hakk vev med fin saks. Den optimale størrelsen er 0,5 cm2 per stykke. Tarmvevet skal passere gjennom en trimmet 1 ml pipettespiss.
  3. Dissosiering av tarmvev
    1. Tilsett 1 ml forvarmet kollagenase I til vevet. Bland vev med kollagenase ved å pipettere 10-15 ganger, og overfør til et 15 ml konisk rør.
    2. Fest røret horisontalt på et shakersett ved 50 o / min. Rist i 20 min ved romtemperatur.
    3. Etter inkubasjonen, fjern rørene fra shakeren, og resuspender løsningen ved å pipetere 10-15 ganger. Valgfritt: Fjern en liten alikot for å verifisere tilstedeværelsen av enkeltkrypter ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.
  4. Isolering av tarmkrypter
    1. Filtrer krypter gjennom en 70 μm sil til et 50 ml konisk rør på is. Vask silen med 9 ml iskaldt vaskemedium. Overfør filtratet til et 15 ml konisk rør.
    2. Sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og fjern forsiktig supernatanten. Det vil være omtrent 200 μL medier igjen i røret. Heng pelleten på nytt i 5 ml av det iskalde vaskemediet.
    3. Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Resuspender pelleten i 1 ml vaskemedier for vev og overfør til et mikrosentrifugerør på 1,5 ml.
    4. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere kryptene. Aspirer supernatanten forsiktig og fullstendig så mye som mulig ved hjelp av en pipette. Legg røret på is.
  5. Plettering av tarmkrypter
    1. Resuspender pelleten i cellekulturmatrikshydrogel (20 μL / brønn i en 48-brønns vevskulturplate) ved hjelp av en forkjølt pipettespiss for å lage en homogen suspensjon av krypter mens røret forblir på is. Unngå å lage bobler når du pipetterer. Hold tuben på is til den er klar til bruk.
      MERK: Cellekulturmatrikshydrogelen polymeriseres ved temperaturer over 8 °C. Krypter isolert fra et stykke tarmvev 0,5 cm-1 cm i lengde er generelt belagt i 10 brønner av en 48-brønns vevskulturplate.
    2. Plate krypten / cellekulturmatrisen hydrogel suspensjon i en forvarmet 48-brønns vevskulturplate. Varm platen for å hjelpe til med størkning av matrisen. Plasser suspensjonen i midten av brønnen. Unngå bobler når plating.
    3. Inkuber platene i 20 minutter ved 37 °C for å polymerisere matrisen. Det er viktig for cellekulturmatrikshydrogelen å polymerisere fullstendig før tilsetning av medier.
    4. Etter at matrisen polymeriserer, tilsett 300 μL forvarmet 50% L-WRN-betinget media til hver brønn. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
    5. Bytt media hver 2. til 3. dag. Bytt ut med varme 50 % L-WRN-kondisjonerte medier. Passasje hver 7. til 10. dag. Passage enteroids når de er 50% -90% sammenflytende og utviser knoppdannelse.
      MERK: Mediet må kanskje skiftes oftere hvis det blir gult. Hyppigheten av passasje vil avhenge av enteroid tetthet og veksthastigheten til en bestemt pasients celler. Enteroider må passeres hvis deres sentre blir mørke i utseende.
  6. Passerer enteroidene
    1. Aspirer mediene forsiktig fra brønnene. Vask brønnene forsiktig med 500 μL varm D-PBS. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer matrisen.
    2. Tilsett 250 μL kaldcellegjenvinningsløsning til hver brønn. Skrap bunnen av hver brønn med en ny pipettespiss for å forstyrre cellekulturmatrikshydrogelen. Inkuber platen på is i 30 min.
    3. Dissocier enteroider ved kraftig pipettering (~ 25-50 ganger med P200 pipette) og tilsett 500 μL vevsvaskemedier.
    4. Overfør enteroid suspensjon til et 15 ml rør og tilsett ytterligere 5 ml vaskemedier med kaldt vev. Pipett forsiktig for å danne en homogen løsning.
    5. Sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere enteroidene. Legg slangen på is og aspirer supernatanten så fullstendig som mulig. Det vil være omtrent 30-60 μL igjen i røret.
      MERK: Hvis det er vanskeligheter med å bryte opp enteroider med pipettering, kan 0,25% trypsin-EDTA eller enzymatisk dissosiasjonsreagens benyttes for å lette denne prosessen.
    6. Resuspender enteroider i restvolumet av vaskemedier med en P200-pipette. Unngå bobledannelse mens du pipetterer.
    7. Tilsett 20 μL cellekulturmatrisehydrogel per ny brønn på en 48 brønnplate til enteroidsuspensjonen. Del enteroidene 1: 3, 1: 4 eller 1: 5, avhengig av tettheten.
    8. Legg suspensjonen til en forvarmet 48-brønnsplate. Inkuber platen ved 37 °C i 20 minutter for å størkne matrisen.
    9. Etter polymerisering, tilsett 300 μL forvarmet 50% L-WRN-kondisjonert medium til hver brønn. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.

2. Neonatal tarm-on-a-chip-modell

MERK: For detaljerte instruksjoner om håndtering av mikrofluidiske chips og bruk av dette utstyret, vennligst se produsentens duodenum tarm-chip kulturprotokoll37.

  1. Media forberedelse
    1. Forbered alle medier som kreves som beskrevet i tabell 2. Forsikre deg om at aseptisk teknikk brukes. Filtrer steriliseringsmediet med et 0,2 μm filter og oppbevar ved 4 °C til bruk.
  2. Dag (-3): Tining og ekspandering av humane intestinale mikrovaskulære endotelceller (HIMECs)
    1. Tine et hetteglass med HIMEC og tallerken i henhold til produsentens anbefalinger.
    2. Belegg en 25 cm 2 kolbe med gelatinbasert beleggløsning i2 minutter. Fjern overflødig løsning. Tilsett HIMECs (ca. 0,5-1 x 10 6 celler) resuspendert i6 ml HIMEC-medier til kolben. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
    3. Bytt HIMEC-medier hver 48. Legg HIMECs til endotelkanalen (nederst) på brikken innen 48-72 timer for å bli 100% sammenflytende.
  3. Dag (-1): Aktivering og belegging av sjetongene før tilsetning av enteroider
    1. Rekonstituer chipaktiveringsreagens 1 (CR-1) pulver for å lage CR-1-løsning. Forsikre deg om at CR-1-pulver og sponaktiveringsreagens 2 (CR-2)-oppløsning er ved romtemperatur for dette trinnet.
      MERK: Hold CR-1-pulveret og CR-1-løsningen som er tilberedt i følgende trinn, beskyttet mot lys til enhver tid. Lyset skal være av i panseret for disse trinnene.
      1. Plasser spon- og sponholderen i sponholderen, og legg dem deretter i en vevskulturskål i cellekulturhetten. Se produsentens protokoll for riktig teknikk for chipplassering i bæreren37.
      2. Tilsett 1 ml CR-2-oppløsning til hetteglasset med CR-1 pulver og overfør deretter oppløsningen direkte fra CR-1 pulverhetteglasset til et 15 ml rør innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte det mot lys. Ikke bland oppløsningen med pipetten. Målet er å unngå bobledannelse.
      3. Legg til ytterligere 1 ml CR-2-oppløsning til CR-1-hetteglasset, og overfør til 15 ml røret. Gjenta for totalt 4 skyllinger og totalt 4 ml CR-2 skylles gjennom CR-1 hetteglasset. Sett hetten på hetteglasset og vend den opp ned for den siste skyllingen for å fjerne gjenværende pulver.
      4. Legg til ytterligere 6 ml CR-2 til 15 ml rør inneholdende CR-1 for et endelig volum på 10 ml (0,5 mg / ml). Bland denne løsningen med en pipette uten å introdusere bobler. Forsikre deg om at CR-1 er fullstendig oppløst før du går videre til neste trinn.
    2. Tilsetning av CR-1-løsning til chip
      MERK: Det er viktig å unngå å introdusere bobler til kanalene mens du legger til disse løsningene. CR-1-løsningen bør forbli beskyttet mot lys i dette trinnet.
      1. Bruk en 200 μL pipettespiss til å tilsette 20 μL CR-1-løsning til bunnkanalinnløpet til løsningen begynner å gå ut av bunnkanalutløpet. Tilsett 50 μL CR-1-løsning gjennom toppkanalinnløpet til løsningen begynner å gå ut av toppkanalutløpet. Fjern overflødig CR-1-løsning fra overflaten av brikken ved forsiktig aspirasjon.
        MERK: Løsninger bør alltid legges til bunnkanalen før toppkanalen. Hvis bobler er notert, skyll begge kanalene med CR-1-løsning og gjenta 2.3.2.1.
      2. Hvis lokket på vevskulturfatet som inneholder sjetongene er på plass, fjern det for dette trinnet. Plasser spon under UV-lys i 15 min. Fjern CR-1 fra topp- og bunnkanalene.
      3. Gjenta trinn 2.3.2.1 til og med 2.3.2.2 for totalt to UV-aktiveringstrinn. Etter dette trinnet er sjetongene ikke lenger lysfølsomme.
      4. Fjern CR-1 fra topp- og bunnkanalene. Vask begge kanalene med 100 μL CR-2-løsning. Fjern CR-2-løsningen fra topp- og bunnkanalene.
      5. Vask begge kanalene med 100 μL steril D-PBS. Gjenta vaskene 2x. Legg til 100 μL D-PBS til begge kanalene. Fjern overflødig fra overflaten av sjetongene, men la kanalene være fulle.
    3. Frakkkanaler med den ekstracellulære matrisen.
      1. Tine fibronektin, kollagen IV og cellekulturmatrikshydrogel på is umiddelbart før dette trinnet, og oppbevar disse løsningene på is resten av denne delen.
      2. Forbered følgende ekstracellulære matriseløsninger (ECM) for de øverste og nederste kanalene på brikken:
        Toppkanal: 100 μL av 200 μg / ml type IV kollagen og 100 μg / ml cellekulturmatrikshydrogel i D-PBS per brikke.
        Bunnkanal: 100 μL av 200 μg / ml type IV kollagen og 30 μg / ml fibronektin i D-PBS per chip.
      3. Fjern D-PBS helt fra topp- og bunnkanalene. Tilsett 50 μL ECM til det nederste kanalinntaket til en dråpe kommer til syne på utløpet. Gjenta for den øvre kanalen. Sørg for å bruke de riktige ECM-løsningene for hver kanal, og legg til løsningen i bunnkanalen først.
      4. Legg D-PBS til sponholderbeholderen og sett lokket på vevskulturplaten. Legg sponsene i en fuktet 37 °C, 5% CO2 inkubator over natten.
  4. Dag (0): Seeding chips med HIMECs og enteroider
    1. Vakuumlikevekt av medier
      1. Legg til det nødvendige volumet av HIMEC-medier og sponekspansjonsmedier for å fullføre eksperimentet til et sterilt 50 ml konisk rør. Likevektsmediet til 37 °C i vannbad i minst 1 time.
      2. Koble vakuumfiltreringsenheten til 50 ml rør som inneholder oppvarmede medier. Rørene skal være orientert med det forvarmede mediet i bunnen av det koniske røret på 50 ml. Vakuum ved -70 kPa eller høyere i 10 s.
      3. Vend rørene slik at mediet beveger seg gjennom filteret. Fortsett å støvsuge i 5 minutter. Når vakuumfiltreringen er fullført, fjerner du vakuumfiltreringsanordningen og plasserer de 50 ml rørene som inneholder medier i inkubatoren på 37 °C.
    2. Vasker chipsene
      1. Vask endotelkanalen ved å skylle med 100 mikrol forvarmede HIMEC-medier.
        Vask epitelkanalen ved å skylle med 100 μL forvarmet sponekspansjonsmedium. Fjern alle medier som sprer seg på overflaten av sjetongene.
      2. Gjenta vasketrinnet. Media bør forbli i kanalene samt innløps- og utløpsporter etter disse spylingene. Sett lokket på kulturfatet som inneholder sjetongene og gå tilbake til inkubatoren til den er klar til bruk.
    3. Høsting av HIMECs
      1. Aspiratmedier fra 25 cm2 kolben som inneholder HIMEC. Vask monolaget forsiktig med D-PBS. Tilsett 2 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA til kolben og skyll forsiktig over monolaget.
      2. Inkuber kolben ved 37 °C i 2-5 minutter. Nøytraliser trypsin med 10 ml HIMEC-medier. Resuspender celler i media og overfør til et 15 ml rør.
      3. Spinn ved celle 150 x g i 5 min. ved 4 °C. Resuspendere celler i 200 mikrol HIMEC-medier.
      4. Fjern 10 μL celler og legg røret på is. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller. Den ønskede konsentrasjonen av HIMEC er 6 x 10 6 til 8 x 106 celler/ml.
    4. Seeding HIMECs på brikken
      1. Fjern brikken fra inkubatoren og ta den inn i hetten. Aspirer eventuelle medier som kan ha lekket på overflaten av brikken.
      2. Skyll epitelkanalen (øverst) på brikken med 100 μL forvarmet chipekspansjonsmedium. Skyll den endoteliale (nederste) kanalen på brikken med 100 μL forvarmede HIMEC-medier.
      3. Resuspender HIMEC forsiktig for å oppnå en homogen fordeling. Fjern mediet helt fra endotelkanalen (nederst). Tilsett 10 μL HIMECs (~ 36 000 celler / chip) til endotelkanalen (nederst).
        MERK: Hvis det er vanskelig å fylle HIMEC-kanalen uten bobledannelse ved bruk av 10 μL HIMEC, øk volumet av tilsatte celler. Det skal være samme antall celler per brikke.
      4. Legg til ytterligere organoid vekstmedium til epitelkanalen (øverst) hvis den ikke er full. Kontroller såtettheten til HIMEC-ene. Hvis de ikke er jevnt fordelt og ikke dekker 80% -90% av sponoverflaten, skyll kanalen og gjenta såingen.
      5. Inverter brikken i chipholderen i cellekulturfatet. Legg D-PBS til reservoaret i sponholderen. Sett lokket på cellekulturskålen og legg det i inkubatoren.
      6. La brikken stå invertert ved 37 °C i 2-3 timer slik at HIMEC kan festes til sponmembranen. Etter at inkubasjonen er fullført, returner spon / sponholderen til oppreist stilling.
      7. Vask endotelkanalen (nederst) forsiktig med 100 μl varme HIMEC-medier. La media være i kanalen. Vask forsiktig epitelkanalen (øverst) med 100 μL organoid vekstmedium. La media være i kanalen.
      8. Returner sjetonger til 37 ° C inkubatoren mens du fullfører de neste trinnene.
    5. Høsting av enteroider og såing på flis
      MERK: Chips er sådd med enteroider som ble delt 10-14 dager før, er 50% -75% sammenflytende, og ved passasje 7 og 20. Se figur 2 for utseende av enteroider på dag 0. Tiden som kreves for enteroider å være klar for såing, vil avhenge av veksthastigheten til en bestemt pasients celler.
      1. Aspirer mediene forsiktig fra brønnene. Vask forsiktig brønner som inneholder cellekulturmatrikshydrogel med 500 μL varm D-PBS. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer cellekulturmatrisehydrogelen.
      2. Tilsett 250 μL kaldcellegjenvinningsløsning til hver brønn. Skrap bunnen av hver brønn med en ny pipettespiss for å forstyrre cellekulturmatrikshydrogelen. Tilsett innhold av brønner i et kaldt 15 ml rør på is.
      3. Inkuber røret på is i 45 min, og snu røret hver 3-5 min. I løpet av dette trinnet, forberede enteroid dissosiasjon media. Plasser dette mediet i vannbadet på 37 °C når det er 10 minutter igjen av inkubasjonstrinnet.
      4. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere enteroidene. Fjern supernatanten.
      5. Tilsett 2 ml enteroid dissosiasjonsmedium per høstet plate til pelleten og sett i et 37 °C vannbad i 60 s til 120 s. Virvle røret forsiktig under inkubasjon. Inkubere lenge nok til å oppnå fragmenterte enteroider, men uten dissosiasjon i en enkelt celle suspensjon.
      6. Etter inkubering, tilsett 10 ml vaskemedier av kaldt vev til hver 15 ml tube. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere enteroidene. Aspirer supernatanten helt.
      7. Resuspender pelleten i 200 μL sponekspansjonsmedier. Dissosiere enteroider ved kraftig pipettering (~25-50 ganger med P200-pipette).
      8. Kombiner celler i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pipett forsiktig for å danne en homogen løsning. Målet er å frø brikken med fragmenterte enteroider i små klynger på 10-30 celler.
      9. Fjern 10 μL cellesuspensjon for telling. Plasser den gjenværende cellesuspensjonen på is. Juster volumet av chipekspansjonsmedier for å oppnå en konsentrasjon på 6 x 106 celler/ml.
        MERK: Det kan være nødvendig å sentrifugere enteroider og resuspendere dem i et mindre volum av media for å oppnå den nødvendige tettheten.
      10. Ta de mikrofluidiske brikkene inn i hetten og aspirer mediet fra epitelkanalen (øverst) på brikken. Legg i den øverste kanalen på brikken med 30 μL resuspenderte celler (~ 180 000 celler / chip). Sørg for fullstendig og jevn dekning av epitelkanalen til brikken for dannelse av et monolag. Hvis dette ikke oppnås, skyll enteroidene gjennom brikken og frø på nytt.
        MERK: Hvis det er vanskeligheter med å oppnå en jevn suspensjon mens du laster flere chips, kan enteroidene separeres i 40 μL alikoter i individuelle 1,5 ml mikrosentrifugerør. Dette vil minimere variabiliteten i enteroidtallene og fragmentstørrelsen etter hvert som lastingen fortsetter.
      11. Sett sjetongene tilbake i sponholderen i cellekulturfatet (hvis de er fjernet). Legg D-PBS til reservoaret i sponholderen. Sett lokket tilbake på cellekulturfatet, og legg spon ved 37 °C, 5% CO2 over natten.
  5. Dag (1): Forbereder pods og introduserer flyt til chips
    1. Ta sjetongene inn i vevskulturhetten. Skyll epitelkanalen forsiktig to ganger med 100 μL sponekspansjonsmedier. Skyll endotelkanalen forsiktig to ganger med 100 mikroliter HIMEC-medier. Fjern overflødig media fra chipoverflaten.
    2. Prime pods og regulere i henhold til produsentens protokoll37. Tilsett 2 ml egnet medium til innløpsbeholderne. Tilsett 300 μL av passende medier til utløpsbeholderne. Strømningshastigheten vil være 30 μL/t. Strekning vil ikke bli igangsatt ennå.
  6. Dag (2): Overvåking av monolagsutvikling og endring av medier
    1. Sett kulturmodulen på pause og før belgene inn i panseret.
    2. Inspiser chips og pods for bobler. Undersøk epitelmonolaget ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Ta bilder på konsekvente steder over hele brikken for å overvåke fremdriften. Se for deg sjetongene mens de forblir i belgene.
    3. Fjern mediet fra de øvre kanalinnløpsreservoarene og erstatt det med 2 ml spondifferensieringsmedier. Tilsett 1 ml HIMEC-medier til innløpsbeholderen i nedre kanal. La det være nok medier i innløpsreservoarene for å sikre at bunnen av reservoaret forblir dekket med et tynt lag av media.
    4. Sett belgene tilbake i dyrkningsmodulen og start flyten på nytt ved 30 μL/t.
  7. Dag (3): Overvåke monolagsutvikling, initiere strekking og legge til medier
    1. Gjenta trinn 2.6.1.1. og 2.6.1.2. Tilsett 1 ml spondifferensieringsmedier til det øvre kanalinnløpsreservoaret og tilsett 1 ml HIMEC-medier til det nedre kanalinnløpsreservoaret.
      MERK: Fjern media fra utløpsreservoarene til begge kanalene når de begynner å nå 50-75% kapasitet.
    2. Sett podsene tilbake til kulturmodulen. Start flyten på nytt ved 30 μL/t, og start strekk ved 2 % belastning og en frekvens på 0,2 Hz.
  8. Dag (4): Overvåke monolagsutvikling, øke strekk og legge til medier
    1. Gjenta trinn 2.6.1.1. og 2.6.1.2. Tilsett 1 ml spondifferensieringsmedier til det øvre kanalinnløpsreservoaret og tilsett 1 ml HIMEC-medier til det nedre kanalinnløpsreservoaret.
      MERK: Fjern media fra utløpsreservoarene til begge kanalene når de begynner å nå 50-75% kapasitet.
    2. Sett podsene tilbake til kulturmodulen. Start flyten på nytt ved 30 μL/t og øk strekket til 10 % belastning og en frekvens på 0,2 Hz.
  9. Dag (5) til dag (7): Overvåke monolagsutvikling og legge til medier
    1. Gjenta trinn 2.6.1.1. og 2.6.1.2. Tilsett 1 ml spondifferensieringsmedier til det øvre kanalinnløpsreservoaret og tilsett 1 ml HIMEC-medier til det nedre kanalinnløpsreservoaret.
    2. Sett podsene tilbake til kulturmodulen, og start flyten og strekk på nytt. Når villus-lignende akser er visualisert, fortsett til NEC-on-a-chip-modellen.

3. NEC-on-a-chip-modell

  1. Kultur av tarmbakterier
    MERK: Dette trinnet krever et pre-titrert frosset lager av enteriske bakterier fra en pasient med NEC som er forberedt før oppstart av denne protokollen. For disse forsøkene ble en tidligere beskrevet polymikrobiell enterisk bakterieoppslemming fra en pasient med alvorlig kirurgisk NEC brukt38.
    1. Lag et 50% glyserollager av enteriske bakterier og oppbevar i en -80 ° C fryser til videre bruk.
    2. Tine en alikot av tarmbakteriene og inokulere 10 μL i 3 ml Luria-Bertani (LB) media. Inkuber ved 37 °C med risting ved 150 o / min over natten.
    3. Vask kanalene forsiktig samme dag med 100 μL forvarmede antibiotikafrie spondifferensieringsmedier (toppkanal) eller 100 μL forvarmede antibiotikafrie HIMEC-medier (nederste kanal). Aspirer mediet helt og gjenta spylingen i totalt 3 vask.
    4. Etter å ha aspirert den tredje vasken, bytt ut mediet i kanalene og la det stå på plass.
    5. Skyll innløpsbeholdere øverst og nederst med steril D-PBS og fyll deretter med 3 ml egnet antibiotikafritt medium. Prime pods og regulere som i 2.5.2.
    6. Sett brikken tilbake i dyrkingsmodulen, og start strekk og flyt på nytt.
    7. Neste morgen, ta 1 ml av den nattlige bakteriekulturen og inokuler den i 25 ml ferske LB-medier.
    8. Sett denne nye kulturen tilbake til 37 °C shakeren til OD600 når 0,6 ± 0,02 målt med en 1 cm kuvette. Fortynn bakteriekulturen til 7 x 108 kolonidannende enheter/ml i antibiotikafrie chipekspansjonsmedier.
    9. Lagre en aliquot av denne kulturen for å bekrefte konsentrasjonen av inokulumet39. Det kan være nødvendig å justere konsentrasjonen av bakteriene avhengig av epitelets respons.
    10. Fjern mediet fra epitelkanalen (øverst). Tilsett 30 μL av bakteriekulturen fortynnet i antibiotikafrie chipekspansjonsmedier til den øverste kanalen på brikken. Vær veldig forsiktig med å unngå krysskontaminering av HIMEC (endotel) kanalen med bakterier. Fjern eventuelle ekstra medier fra overflaten av brikken.
    11. La sjetongene forbli under statiske forhold i 30 minutter for å lette bakteriell adherens til den apikale siden av det nyfødte epitelet. Etter inkubasjonen, skyll toppkanalen med 100 μL antibiotikafrie ekspansjonsmedier for å fjerne ikke-festede bakterier. Returner spon til kulturmodulen og start strekk og flyt på nytt.
    12. Hver 24. time, fjern belgene fra kulturmodulen, og skyll sakte 100 μL antibiotikafrie chipekspansjonsmedier gjennom epitelkanalen. Dette vil hjelpe til med å forhindre bakteriell overvekst.

4. Intestinal permeabilitetsanalyse

MERK: Dette kan utføres når som helst under protokollen. Hvis initiert når chips er sådd, kan tarmpermeabilitetsanalysen brukes til å serielt vurdere monolagskonfluens. Hvis initiert ved tilsetning av tarmbakterier, kan denne analysen brukes til å bestemme påvirkning av tarmbakterier på tarmepitelial monolagsintegritet.

  1. Fjern medier fra innløpsbeholderen for epitelkanalen (øverst). Tilsett egnet medium som inneholder permeabilitetsfargestoff (50 μg/ml) i innløpsbeholderen. Bruk antibiotikafrie chipdifferensieringsmedier for NEC-on-a-chip-modellen.
  2. Samle avløpene fra epitel- og endotelkanaler hver 24. Kvantifiser konsentrasjonen av permeabilitetsfargestoff ved å bruke en mikroplateleser i henhold til Lanik et al.36.

5. Immunhistokjemi

  1. Vask forsiktig bunnkanalen og toppkanalen på brikken med 200 μL D-PBS. Aspirer D-PBS helt fra kanalene.
  2. Fest cellene ved å skylle begge kanalene med 4% paraformaldehyd, og la løsningen ligge i kanalene. Aspirer overflødig fra sponoverflaten. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
  3. Vask begge kanalene med 200 μL D-PBS. La D-PBS være i bunnkanalen og fjern den helt fra toppkanalen.
  4. Permeabiliser epitellaget ved å skylle toppkanalen med 100 μL 0,1% vaskemiddelløsning, og etterlate oppløsning i kanalene. Aspirer overflødig fra sponoverflaten, og inkuber ved romtemperatur i 45 minutter.
  5. Vask begge kanalene med 200 μL D-PBS. La D-PBS være i bunnkanalen og fjern den helt fra toppkanalen.
  6. Tilsett 10% eseserum (eller et passende blokkeringsmiddel) til toppkanalen i 1 time ved romtemperatur. Vask begge kanalene med 200 μL D-PBS. La D-PBS være i bunnkanalen og fjern den helt fra toppkanalen.
  7. Fortynn primære antistoffer i 5% eselserum og legg til den øverste kanalen i brikken (antistoffer og konsentrasjoner som tidligere er testet er tilgjengelige i Lanik et al.36). Inkuber ved 4 °C over natten.
  8. Vask begge kanalene 3x med 200 μL D-PBS. La D-PBS være i bunnkanalen og fjern den helt fra toppkanalen.
  9. Fortynnede fluorescerende merkede sekundære antistoffer fortynnet 1:200 i 5% eselserum i D-PBS og enten Hoechst 33342 eller DAPI (nukleære flekker). Legg sekundære antistoffer til den øverste kanalen på brikken. Inkuber ved romtemperatur i 1 time, beskyttet mot lys.
  10. Vask begge kanalene 3x med 200 μL D-PBS. La kanalene være fylt med D-PBS etter siste vask. Legg brikken i en bildeskål med D-PBS for bildeopptak ved hjelp av konfokalmikroskopi.
    MERK: Faste spon, enten flekkete eller ufargede, kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke i PBS. Forsikre deg om at kanalene ikke tørker opp i denne perioden.

6. Isolering av RNA, fremstilling av cDNA og kvantitativ sanntids-PCR

  1. Vask forsiktig bunnkanalen og toppkanalen på brikken med 200 μL D-PBS. Aspirer D-PBS helt fra kanalene.
  2. Trekk ut totalt RNA fra cellene ved hjelp av et RNA-ekstraksjonsreagens i henhold til produsentens instruksjoner. For å isolere RNA bare fra epitelet, fyll bare gjennom toppkanalen.
  3. Kvantifisere RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et nano-volum spektrofotometer. Omvendt transkribere 1 μg totalt RNA. Utfør kvantitativ PCR i sanntid. Primere som tidligere ble brukt i denne modellen er tilgjengelige i Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enteroider ble sådd på den mikrofluidiske enheten (figur 1) og dyrket som beskrevet ovenfor. Vekst av enteroidene i cellekulturmatrikshydrogel før såing og deretter den påfølgende utvidelsen av tarmepitelcellemonolaget etter såing av enheten ble overvåket via lysfeltmikroskopi (figur 2). Et konfluent monolag fra tarmepitelceller dannet og utviklet seg deretter til en moden 3D-villuslignende struktur (figur 2). Denne mikrofluidiske enheten frøet med et enteroid-avledet neonatalt tarmepitel og HIMECs er kjent som neonatal tarm-på-en-chip-modell36.

NEC-on-a-chip-modellen ble utviklet for å rekapitulere den mikrobielle dysbiosen som er tilstede under neonatal NEC. Denne modellen inkluderer tillegg av et dysbiotisk mikrobiom fra en nyfødt med alvorlig NEC til neonatal tarm-på-en-chip-modellen. Med tillegg av dette dysbiotiske mikrobiomet, økte ekspresjonen av en rekke proinflammatoriske cytokiner, inkludert tumornekrosefaktor alfa (TNFα; Figur 3), interleukin (IL)-1 beta (IL-1β)36 og IL-8 ble påvist 36. Denne økningen i proinflammatoriske cytokiner speiler det som er observert for humant NEC36.

Figure 1
Figur 1 Skjematisk fremstilling av enteroidkultur og mikrofluidikkplattformen. Krypter er isolert fra et kirurgisk resektert stykke neonataltarm, og de blir sådd i cellekulturmatrikshydrogel og vokst til intestinale enteroider. Enteroider dissosieres og sås i toppkanalen til mikrofluidikkenheten belagt med ekstracellulær matrise (ECM). Endotelceller (HIMEC) blir deretter lagt til bunnkanalen. Figur opprettet med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Progresjon av intestinale epitelceller dyrket ved hjelp av neonatal tarm-on-a-chip-modellen. Bilder tatt ved hjelp av lysfeltmikroskopi viser neonatale enteroider på dag 0, et epitelcellemonolag i brikken på dag 3 og synlige villuslignende strukturer på dag 7. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. NEC-on-a-chip intestinal epitelcelle TNFα mRNA-ekspresjon. Sammenligning av TNFα mRNA-nivåer ved inkubasjon med media alene (kontroll) eller et dysbiotisk mikrobiom fra et spedbarn med NEC (NEC-on-a-chip) i 24 timer eller 72 timer. **** p < 0,0001 vs. kontroll 24 timer; ** p < 0,005 vs. kontroll 72 timer av Mann-Whitney U test. n=9 for kontroll 24 timer; n = 10 for NEC-on-a-chip 24 timer; n=6 for kontroll 72 timer; n=5 for NEC-on-a-chip 72 timer. Data er ment ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Mediekomposisjon for kryptisolasjon og enteroidvekst. Se Van Dussen et al.40 og Miyoshi et al.41 for detaljerte metoder som beskriver fremstillingen av L-WRN betingede medier. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2. Mediekomposisjon for NEC-on-a-chip-modellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette NEC-on-a-chip-systemet er et kraftig nytt verktøy som kan brukes til å modellere patofysiologien til NEC. Denne plattformen gir et komplekst mikromiljø som ligner mer på in vivo tarmmiljøet enn tidligere modeller ved å inkorporere et samkultursystem med kontinuerlig luminal strømning og strekk. Disse forholdene fremmer utviklingen av 3D villus-lignende arkitektur omgitt av et svært polarisert epitel bestående av modne epitelundertyper og tette kryss (figur 2) 36. I tillegg er den apikale epiteloverflaten lett tilgjengelig for eksponering for eksperimentelle stimuli, for eksempel pasientavledet mikrobiota eller nye terapier. Endelig kan denne modellen også brukes til å studere en rekke inflammatoriske og ikke-inflammatoriske tarmsykdommer, samt mekanismer for normal intestinal epitelutvikling, ved å benytte enteroider avledet fra de relevante pasientpopulasjonene. Denne modellen muliggjør maksimering av datainnsamling fra en enkelt pasientprøve, noe som er viktig gitt den begrensede tilgjengeligheten og størrelsen på neonatale tarmprøver.

Ved hjelp av denne modellen ble mange av de fysiologiske endringene i tarmepitelet som oppstår under NEC hos spedbarn observert. Tilsetningen av det dysbiotiske mikrobiomet fra en pasient med alvorlig NEC førte til oppregulering av inflammatoriske cytokiner (figur 3), økt tarmbarrierepermeabilitet, forbedret celledød, redusert spredning og tap av modne epitelundertyper36. Dermed kan fremtidige studier som bruker denne modellen fokusere på å bestemme mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av NEC og mulige terapeutiske inngrep.

Det er iboende begrensninger i å implementere en kompleks modell som NEC-on-a-chip. Dette systemet krever spesialisert utstyr, reagenser og trening for å utnytte mikrofluidikkplattformen. I tillegg krever modellen nøye oppmerksomhet på detaljer med nøyaktig forberedelse av de forskjellige mediene, riktig såing av brikken og vedlikehold av steril teknikk, som er kritisk for suksess. Etterforskere må også ha tilgang til tarmprøver eller enteroider fra nyfødte pasienter, som vanligvis bare er tilgjengelige på kvartære omsorgssentre med pediatriske kirurger, med mindre de er oppnådd gjennom samarbeidspartnere. Til slutt øker inkorporering av flere viktige komponenter i patofysiologien til NEC, som immunceller eller hypoksi, vanskeligheten med denne modellen ytterligere, selv om den øker den fysiologiske relevansen.

Oppsummert er NEC-on-a-chip et viktig fremskritt innen NEC-forskning som vil forbedre kvaliteten på mekanistiske studier og legge til rette for testing av nye terapier for NEC. Det endelige målet med denne forskningen er å designe og teste målrettede terapier som forbedrer resultatene for spedbarn med tarmbetennelse og NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter knyttet til dette manuskriptet.

Acknowledgments

Dette manuskriptet ble støttet av R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) og R01HD105301 (MG) fra National Institutes of Health, Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), en Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), en UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) gjennom sjenerøs støtte fra givere til University of North Carolina på Chapel Hill, og Institutt for pediatri ved University of North Carolina i Chapel Hill.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

Mikrofluidisk modell nekrotiserende enterokolitt humane neonatale tarmenteroider dysbiotisk mikrobiom kompleks patogenese tarmtette kryss permeabilitet av tarmbarriere epitelcelledød mikrobiell dysbiose dysregulert betennelse dyremodeller cellelinjer intestinale organoider in vitro-modell mikrofluidisk teknologi NEC-on-a-chip preterm nyfødt humane endotelceller testing av narkotikaforskning
Mikrofluidisk modell av nekrotiserende enterokolitt som inneholder humane neonatale intestinale enteroider og et dysbiotisk mikrobiom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter