Summary

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Abstract

La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad intestinal grave y potencialmente mortal que ha sido difícil de estudiar debido a su compleja patogenia, que sigue sin comprenderse completamente. La fisiopatología de la ECN incluye la alteración de las uniones estrechas intestinales, el aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal, la muerte de las células epiteliales, la disbiosis microbiana y la inflamación desregulada. Las herramientas tradicionales para estudiar la ECN incluyen modelos animales, líneas celulares y organoides intestinales humanos o de ratón. Si bien los estudios que utilizan esos sistemas modelo han mejorado la comprensión del campo de la fisiopatología de la enfermedad, su capacidad para recapitular la complejidad de la ECN humana es limitada. Ahora se ha desarrollado un modelo in vitro mejorado de NEC que utiliza tecnología microfluídica, denominado NEC-on-a-chip. El modelo NEC-on-a-chip consiste en un dispositivo microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados de un neonato prematuro, cocultivado con células endoteliales humanas y el microbioma de un lactante con ECN grave. Este modelo es una herramienta valiosa para los estudios mecanicistas sobre la fisiopatología de la ECN y un nuevo recurso para las pruebas de descubrimiento de fármacos para las enfermedades intestinales neonatales. En este manuscrito, se proporcionará una descripción detallada del modelo NEC en un chip.

Introduction

La enterocolitis necrotizante (ECN) afecta a los prematuros, con una incidencia de hasta el 10% en los nacidos con un peso < 1500 g1. La fisiopatología de la ECN es compleja e incluye daño al epitelio intestinal, alteración de las uniones estrechas intestinales, aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal, desregulación inmunitaria y muerte de células epiteliales 2,3. Nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la patogénesis de la ECN sigue siendo incompleta y, a pesar de décadas de investigación, todavía no existen terapias dirigidas eficaces.

Un obstáculo importante para el avance de la investigación de la ECN es la disponibilidad limitada y el pequeño tamaño del tejido intestinal primario aislado de bebés humanos. El tejido intestinal extirpado de lactantes con ECN suele estar necrótico y gravemente dañado, lo que complica los estudios sobre los mecanismos que preceden a la aparición de la enfermedad. Por ejemplo, el intestino delgado de los lactantes con ECN está inundado de células inmunitarias, y también se observa una reducción del número de células madre intestinales, una disminución de la proliferación de células epiteliales y un aumento de la apoptosis de las células epiteliales 4,5,6,7. Esto conduce a dificultades en el cultivo de células epiteliales intestinales a partir de estas muestras y en el aislamiento de ARN y proteínas, que pueden degradarse en este entorno inflamatorio hostil. Además, dado que el proceso de la enfermedad ya está avanzado en los lactantes con ECN quirúrgica, los estudios mecanicistas sobre los factores que inducen la enfermedad son inviables. Estas limitaciones han llevado a una dependencia de los modelos animales para los estudios mecanicistas de la ECN.

Se han establecido modelos animales de ECN para ratones, ratas, lechones, conejos y babuinos 5,8,9,11. Una fortaleza de los modelos animales es que la enfermedad intestinal similar a la ECN es inducida por factores asociados con la aparición de ECN en los seres humanos, incluido un microbioma disbiótico, episodios repetidos de hipoxia y la ausencia de alimentación con leche materna 5,8,10,11. Además, la respuesta inflamatoria y los cambios patológicos observados durante la ECN experimental son paralelos a la enfermedad humana 5,9,12. Si bien estos modelos imitan muchas de las características de la ECN humana, existen diferencias inherentes entre la fisiopatología de la ECN en animales y humanos. Por ejemplo, el modelo murino de ECN se induce en ratones nacidos a término, y aunque su desarrollo intestinal es incompleto, la fisiopatología de ECN es inherentemente diferente en este contexto clínico. La expresión génica intestinal murina al nacer es similar a la de un feto humano previable y no se aproxima a la de un neonato prematuro de 22-24 semanas de gestación hasta el día 14 (P14)13. Esto confunde el modelo murino de ECN porque generalmente no se puede inducir lesión intestinal en ratones después de P10. Además, las cepas endogámicas de ratones carecen de la diversidad inmunológica14 y microbiológica de los neonatos humanos15, lo que sirve como otro factor de confusión. Por lo tanto, una mayor incorporación de muestras humanas primarias en la investigación de ECN mejora la relevancia clínica de los estudios en este campo.

Los estudios sobre los mecanismos de la ECN in vitro han utilizado tradicionalmente líneas celulares monotípicas derivadas de células adultas de cáncer intestinal, como el adenocarcinoma colorrectal (Caco2) y las células del adenocarcinoma de colon humano (HT-29)16. Estos modelos son convenientes, pero tienen una relevancia fisiológica limitada debido a su crecimiento a partir de células cancerosas adultas, su arquitectura no polarizada y los cambios fenotípicos relacionados con los pasajes repetidos en el cultivo. Los enteroides intestinales mejoran estos modelos, ya que pueden crecer a partir de las criptas del tejido intestinal, diferenciarse en todos los subtipos epiteliales intestinales y formar una estructura tridimensional (3D) similar a una vellosidad17,18,19,20. Recientemente, los enteroides intestinales se han combinado con la tecnología microfluídica para desarrollar un modelo de intestino delgado en un chip y proporcionar un sistema modelo in vitro fisiológicamente más relevante21.

Los primeros dispositivos microfluídicos de órgano en un chip se introdujeron a principios de la década de 200022,23,24. El primer modelo de órgano en un chip fue el pulmón en un chip de respiración humana25. A esto le siguieron numerosos modelos de un solo órgano, como el intestino21, el hígado26, los riñones 27, la médula ósea 28, la barrera hematoencefálica29 y el corazón30. Estos modelos de órganos en un chip se han utilizado para estudiar enfermedades agudas, crónicas y raras, incluido el síndrome de radiación aguda,31 la enfermedad pulmonar obstructiva crónica,32 y las enfermedades neurodegenerativas,33. La naturaleza polarizada de las células en estos chips y la presencia de dos compartimentos celulares separados por una membrana porosa permite modelar procesos fisiológicos complejos como la perfusión, los gradientes de concentración química y la quimiotaxis de las células inmunitarias34,35. Estos sistemas microfluídicos proporcionan así una nueva herramienta para estudiar la fisiopatología y los mecanismos de las enfermedades humanas.

El modelo de intestino delgado en un chip fue descrito por Kasendra et al. en 2018, quienes utilizaron muestras de biopsia de intestino delgado pediátricas (de 10 a 14 años) diferenciadas en enteroides y cultivadas en un dispositivo microfluídico21. Las células endoteliales vasculares, el flujo continuo de medios y el estiramiento/relajación también se incorporaron a este modelo. Observaron la diferenciación de los subtipos epiteliales intestinales, la formación de ejes en forma de vellosidades en 3D, la producción de moco y los patrones de expresión génica del intestino delgado21. Este modelo microfluídico se aplicó a la enfermedad neonatal con el desarrollo del sistema NEC-on-a-chip, que incorpora enteroides intestinales neonatales, células endoteliales y el microbioma de un neonato con NEC36. La ECN en un chip recapitula muchas de las características críticas de la ECN humana, incluida la expresión génica inflamatoria, la pérdida de células epiteliales especializadas y la reducción de la función de barrera intestinal36. Por lo tanto, este modelo tiene numerosas aplicaciones en el estudio de la ECN, incluidos los estudios mecanicistas y el descubrimiento de fármacos. En este manuscrito, se proporciona un protocolo detallado para el rendimiento del modelo NEC en un chip.

Protocol

Los enteroides se derivaron de muestras del intestino delgado de lactantes prematuros (nacidos entre las semanas 22 y 36 de gestación) obtenidas en el momento de la cirugía por ECN u otras afecciones intestinales con etiologías no inflamatorias. Toda la recolección y el procesamiento de muestras se realizaron después del consentimiento informado y la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Washington en St. Louis (números de protocolo 201706182 y 201804040) y de la Universidad de C…

Representative Results

Los enteroides se sembraron en el dispositivo microfluídico (Figura 1) y se cultivaron como se describió anteriormente. El crecimiento de los enteroides en el hidrogel de la matriz de cultivo celular antes de la siembra y luego la posterior expansión de la monocapa de células epiteliales intestinales después de la siembra del dispositivo se monitoreó mediante microscopía de campo claro (Figura 2). Se formó una monocapa de células epiteliales intestinale…

Discussion

Este sistema de ECN en un chip es una nueva y poderosa herramienta que se puede utilizar para modelar la fisiopatología de la ECN. Esta plataforma proporciona un microambiente complejo que se asemeja más al medio intestinal in vivo que los modelos anteriores al incorporar un sistema de cocultivo con flujo y estiramiento luminal continuo. Estas condiciones promueven el desarrollo de una arquitectura 3D similar a una vellosidad revestida por un epitelio altamente polarizado que consiste en subtipos epiteliales m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este manuscrito fue apoyado por R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) y R01HD105301 (MG) de los Institutos Nacionales de Salud, la Subvención de la Iniciativa Chan Zuckerberg 2022-316749 (MG), un Premio de Carrera Temprana (LCF) del Fondo de Investigación Thrasher, una Subvención de Investigador de Carrera Temprana (LCF) de Desarrollo Infantil de la UNC a través del generoso apoyo de los donantes de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y el Departamento de Pediatría de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

Materials

[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) Invitrogen D3571
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. . Duodenum Intestine-Chip Protocol. , (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Play Video

Cite This Article
Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

View Video