Denne protokol beskriver en metode til at inducere en nøjagtig og reproducerbar hornhinde- og limbalalkaliskade i en musemodel. Protokollen er fordelagtig, da den giver mulighed for en jævnt fordelt skade på den stærkt buede musehornhinde og limbus.
Hornhinden er afgørende for synet, og hornhindeheling efter traumer er grundlæggende for at opretholde dens gennemsigtighed og funktion. Gennem studiet af modeller for hornhindeskader sigter forskerne mod at forbedre deres forståelse af, hvordan hornhinden heler og udvikle strategier til forebyggelse og håndtering af uklarheder i hornhinden. Kemisk skade er en af de mest populære skademodeller, der er blevet grundigt undersøgt på mus. De fleste tidligere efterforskere har brugt et fladt papir gennemblødt i natriumhydroxid for at fremkalde hornhindeskade. Imidlertid er det upålideligt at fremkalde hornhinde- og limbalskader ved hjælp af fladt filterpapir, da musehornhinden er meget buet. Her præsenterer vi et nyt instrument, et modificeret biopsislag, der gør det muligt for forskerne at skabe en velafgrænset, lokaliseret og jævnt fordelt alkaliskade på murinhinden og limbussen. Denne punch-trephin-metode gør det muligt for forskere at fremkalde en nøjagtig og reproducerbar kemisk forbrænding til hele murinhinden og limbussen, mens andre strukturer, såsom øjenlågene, forbliver upåvirket af kemikaliet. Desuden introducerer denne undersøgelse en enukleationsteknik, der bevarer den mediale caruncle som et vartegn for at identificere næsesiden af kloden. Bulbar og palpebral conjunctiva og lacrimalkirtel holdes også intakte ved hjælp af denne teknik. Oftalmologiske undersøgelser blev udført via spaltelampebiomikroskop og fluoresceinfarvning på dag 0, 1, 2, 6, 8 og 14 efter skade. Kliniske, histologiske og immunhistokemiske fund bekræftede limbal stamcellemangel og okulær overflade regenereringssvigt hos alle eksperimentelle mus. Den præsenterede alkaliske hornhindeskademodel er ideel til undersøgelse af limbalstamcellemangel, hornhindebetændelse og fibrose. Denne metode er også velegnet til undersøgelse af prækliniske og kliniske virkninger af topiske oftalmologiske lægemidler på murinhindeoverfladen.
Hornhinden er kritisk for synet og udviser unikke egenskaber, herunder gennemsigtighed, hvilket er en forudsætning for klart syn. Ud over at tjene en stor beskyttende rolle tegner hornhinden sig for 2/3 af øjets brydningskraft1. På grund af hornhindeskader og uigennemsigtighed spiller en væsentlig rolle i synet og er ansvarlige for den næsthøjeste årsag til blindhed, der kan forebygges, på verdensplan 2,3. Ved hornhindeskader med svær limbaldysfunktion falder limbusens barrierefunktion, hvilket resulterer i migration af konjunktivalceller mod hornhindeoverfladen og hornhindekonjunktivalisering 4,5, hvilket kompromitterer synet dramatisk. Der er derfor behov for effektive forebyggende og terapeutiske strategier for at tackle den globale byrde af hornhindeblindhed og dermed forbundne handicap.
Den nuværende forståelse af den menneskelige hornhindes sårhelingsproces er baseret på tidligere undersøgelser, der har undersøgt hornhindens reaktioner på forskellige skader. Flere teknikker og dyremodeller er blevet anvendt til at fremkalde forskellige kemiske eller mekaniske hornhindeskader 6,7,8,9 og til at undersøge forskellige aspekter af hornhindesårets helingsproces.
Alkaliforbrændingsmodellen er en veletableret skademodel, der udføres ved at påføre natriumhydroxid (NaOH) direkte over hornhindeoverfladen eller ved hjælp af fladt filterpapir10. En alkaliskade resulterer i frigivelse af proinflammatoriske mediatorer og infiltration af polymorfonukleære celler, ikke kun i hornhinden og det forreste kammer i øjet, men også i nethinden. Dette inducerer utilsigtet retinal ganglioncelleapoptose og CD45+ celleaktivering11. Derfor er det afgørende at lokalisere skadestedet præcist for at undgå overdreven utilsigtet skade ved hjælp af en alkalisk skademodel.
Den aksiale længde af murine øjeæblet er ca. 3 mm12. På grund af denne korte afstand mellem hornhinden og nethinden findes der en stejl hornhindekrumning for at give høj brydningskraft til at fokusere lyset på nethinden (figur 1A). Som vi tidligere har rapporteret13, er det vanskeligt at fremkalde kemisk skade på denne stærkt buede overflade ved hjælp af et fladt filterpapir, især ved limbus (figur 1B). Inducerende skade på limbussen kræver hældning af filterpapiret, hvilket har potentiale til at forårsage utilsigtet skade på fornix og tilstødende bindehinde14. En anden tilgang indebærer direkte påføring af det kemiske middel som dråber på hornhindeoverfladen. Denne metode mangler imidlertid kontrol over eksponeringstiden, og der er en potentiel risiko for at fremkalde skade på bindehinden, fornix og øjenlåg på grund af diffusionen af væsken til disse områder.
For at overvinde disse begrænsninger præsenterer denne undersøgelse en ny punch-trephin-metode til at fremkalde skade. Denne teknik har flere fordele, herunder (i) inducering af en effektiv kemisk skade på hele hornhindeoverfladen og limbussen i musemodellen, (ii) inducering af en lokaliseret og velafgrænset skade på hornhinden, (iii) evnen til at anvende enhver væske af interesse i en forudbestemt varighed og (iv) evnen til at fremkalde forskellige størrelser af hornhindeskader ved at vælge passende biopsislag. Denne metode er også mulig for rotte- og kaninskademodeller, som også udviser en buet hornhindeoverflade og er almindelige dyremodeller, der bruges til at studere sårheling på okulær overflade.
Denne undersøgelse foreslår en innovativ enhed, punch-trephine, som kan bruges til med succes at fremkalde en effektiv og reproducerbar hornhinde- og limbalskade i en musemodel. Denne limbal stamcellemangelmodel er ideel til at undersøge dynamikken i hornhindesårheling og konjunktivalisering efter skade.
Beviser tyder på, at både limbal niche og centrale del af murin hornhinden indeholder stamceller30. Derfor kræves en effektiv hornhinde- og limbalskade for at producere en stamcellemangelmodel, og skademodellen, der præsenteres her, muliggør eksponering af den buede hornhindelimbus for et kemisk middel i en bestemt periode. For at bestemme den bedste koncentration og varighed af NaOH-skade blev skader påført forskellige NaOH-koncentrationer og varigheder. Højere NaOH-koncentrationer eller længere eksponeringsvarighed resulterede i øget vævsskade og fibrose. Derfor kan forskere justere disse parametre baseret på de specifikke mål for deres undersøgelse og den ønskede sværhedsgrad af skaden.
For at kunne reproducere denne hornhinde- og limbalskademodel bør flere vigtige overvejelser overvejes. For det første er det bydende nødvendigt at måle det målrettede øjes limbal-til-limbale diameter for at bestemme den passende størrelse af stansen. Det anbefales at vælge en biopsistans med en udvendig diameter, der er 0,5 – 1 mm større end denne diameter.
Overfladespændingen af den anvendte væske er en vigtig faktor for at forhindre lækage ved grænsefladen mellem den okulære overflade og kanten af stansetrefinen som vist i figur 1G. Derfor er der ikke behov for at lægge pres på spidsen af stansebiopsi.
For at undgå at forårsage mekanisk skade på vævet er det vigtigt at holde stansetrepfinen i en parallel akse med øjet og afstå fra at lægge pres på limbussen. Forkert justering af stansetrephinaksen kan øge risikoen for lækage og resultere i et degraderet skadested og unøjagtige resultater.
Nogle potentielle begrænsninger ved denne teknik inkluderer behovet for at vælge den passende stansestørrelse, erhverve færdigheder i at holde stansetrephinen og den potentielle risiko for at forårsage mekanisk skade. Disse begrænsninger kan dog overvindes gennem praksis og ved at følge instruktionerne i denne protokol. Musens stamme og aldersgruppe er andre faktorer, der påvirker re-epithelialiseringsprocessen og skal overvejes i undersøgelsen.
Desuden er den foreslåede protokol fordelagtig, da den beskriver en enukleationsmetode, der bevarer bulbar og palpebral conjunctiva og muliggør bestemmelse af den nasale del af kloden uden anvendelse af kirurgiske suturer som markør. Tidligere forskning har vist, at næseområdet i øjet har den laveste neurale innervering sammenlignet med andre områder af hornhinden, hvilket gør det mere sårbart over for neovaskularisering og reduceret regenerativ effekt31,32.
Sammenfattende bekræfter de kliniske tegn på LSCD, såsom hornhindeopacitet (CO), vedvarende epiteldefekter og hornhindeneovaskularisering (NV) sammen med de observerede histologiske ændringer, herunder bægercellemetaplasi, ekspression af K13 på hornhindeoverfladen og fravær af K12 på hornhindeoverfladen, tilstedeværelsen af LSCD i denne model. Disse resultater giver bevis for, at denne nye teknik er effektiv til at inducere LSCD. Denne kemiske skademodel kan anvendes i prækliniske undersøgelser til at undersøge nye lægemidler og farmaceutiske behandlinger inden for hornhindeskade og regenerering.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender, at NEI P30-EY026877 understøtter denne forskning. Vi anerkender i høj grad Charlene Wang og Dr. Irv Weissman Lab ved Stanford University’s Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine for al deres venlige hjælp til at levere forsøgsdyr. Vi sætter pris på Hirad Rezaeipoors hjælp med forberedelsen og redigeringen af billederne.
Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
Curved forceps | Storz | E1885 | |
Disposable 90 degree bent needle | |||
Disposable biopsy punch | Med blades | ||
Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
Heating pad for mouse | |||
Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
Ophthalmic surgical scissors | |||
pH Indicator Sticks | Whatman | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
Timer | |||
Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |