설치류 뼈의 전체 뼈 굽힘 시험과 관련된 연구의 설계, 실행 및 해석에 대한 실용적인 고려 사항
Summary
설치류 뼈의 기계적 검사는 뼈의 골절 민감도에 관한 정보를 추출하는 데 유용한 방법입니다. 적절한 실제적 이해가 부족하면 결과가 과도하게 해석되거나 타당성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유효하고 기능적인 데이터를 제공하기 위해 기계적 테스트가 정확하게 수행되도록 하는 가이드 역할을 합니다.
Abstract
골절로 이어지는 골격계 취약성은 매년 150만 건의 골절과 180억 달러의 직접 치료 비용을 초래하는 미국의 공중 보건 위기입니다. 뼈 질환의 기저와 치료에 대한 반응을 이해하는 능력은 바람직할 뿐만 아니라 매우 중요합니다. 뼈의 기계적 검사는 골절에 대한 뼈의 민감도를 이해하고 정량화하는 데 유용한 기술입니다. 이 방법은 수행하기가 간단해 보이지만 사용자가 관리 가정과 주요 단계를 무시하는 경우 부적절하고 부정확한 결론에 도달할 수 있습니다. 이는 방법의 오용과 결과의 잘못된 해석으로 연구가 계속 발표됨에 따라 학문 전반에 걸쳐 관찰되었습니다. 이 프로토콜은 시료 크기 고려부터 조직 채취 및 저장, 데이터 분석 및 해석에 이르기까지 이러한 기술의 적용과 함께 기계적 테스트와 관련된 원칙에 대한 입문서 역할을 합니다. 이를 통해 뼈의 골절 민감성에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있어 학술 연구와 임상 솔루션 모두에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
Introduction
뼈의 기계적 검사는 골절에 대한 뼈의 민감도와 관련된 기능적 정보를 추출하는 주요 방법입니다. 전임상 연구에서는 여러 가지 검사 방식을 사용할 수 있지만 가장 일반적인 것은 긴 뼈를 구부리는 것입니다. 이 검사는 수행하기 쉬우며 사람에서 쥐에 이르기까지 다양한 크기의 뼈에 사용할 수 있습니다. 마우스는 전임상 연구에서 가장 일반적으로 연구되는 동물 중 하나이기 때문에 이 프로토콜은 마우스의 대퇴골과 경골에 수행되는 굽힘 테스트에 중점을 둘 것입니다.
굽힘 테스트를 수행하기 전에 뼈를 적절하게 채취하고 보관해야 합니다. 가장 일반적인 보관 방법은 전통적으로 식염수에 적신 거즈에 뼈를 얼리거나, 식염수만 넣거나, 에탄올에서 뼈를 탈수하는 것입니다 1. 에탄올에 저장된 골은 냉동 보관된 골에 비해 강성과 탄성 계수가 증가하고 변형 매개변수가 감소하는 것으로 나타났습니다1. 검사 전에 뼈에 수분을 보충해도 이러한 특성이 정상 수준 1로 회복되지 않습니다. 식염수에 담그면 식염수가 팽창할 때 압력이 가해지기 때문에 뼈가 손상될 수 있습니다. 또한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 스캔을 위해 뼈를 제거하기 위해 용액을 완전히 해동해야 합니다. 결과적으로, 갓 채취한 뼈를 식염수에 적신 거즈에 냉동하는 것이 표준 보관 방법이 되었으며 이 프로토콜 전체에서 권장됩니다.
뼈의 크기와 모양이 뼈의 부피 강도에 영향을 미치고 많은 질병 모델이 뼈의 크기와 형태를 크게 변화시키기 때문에 공학적 원리를 사용하여 크기의 영향을 정규화하여 조직의 거동을 추정하는 특성을 생성한다2. 이 접근 방식에는 고장 위치의 단면 형상이 필요하며, 이는 테스트 전에 뼈를 스캔하기 위해 μCT를 사용하여 가장 일반적으로 획득됩니다. μCT는 가용성과 높은 이미지 해상도로 인해 널리 사용됩니다. 더욱이, 연조직의 기여는 포함되지 않으며, 스캐닝은 뼈에 대한 화학적 고정 또는 기타 변형을 필요로 하지 않는다 3,4. 모든 형태의 CT에서 X선 소스는 물체에 초점을 맞추고 물체의 반대쪽에 있는 검출기는 결과 X선 에너지를 측정합니다. 이것은 이미지 3,5로 변환될 수 있는 샘플의 X선 그림자를 생성합니다. 스캔되는 물체가 회전하여(또는 X선 소스와 검출기가 샘플 주위를 회전하여) 물체(5)를 나타내는 3차원 데이터 세트로 재구성될 수 있는 이미지를 생성합니다.
스캔 해상도 또는 두 물체가 얼마나 가까운지, 그리고 여전히 개별적으로 분해될 수 있는지는 공칭 복셀 크기 또는 결과 이미지의 픽셀 크기를 변경하여 제어됩니다. 일반적으로 객체는 단일 복셀의 두 배 이상의 크기여야 식별될 수 있지만3 비율이 높을수록 정밀도가 향상됩니다. 또한, 더 큰 복셀은 부분적인 부피 효과를 더 잘 나타낸다: 단일 복셀이 다양한 밀도의 조직을 포함할 때, 단일 조직의 특정 밀도가 아닌 이러한 밀도의 평균이 할당되며, 이는 조직 면적과 미네랄 밀도의 과대 또는 과소 평가로 이어질 수 있다3. 이러한 문제는 더 작은 복셀 크기를 선택하여 완화할 수 있지만, 더 높은 해상도를 사용한다고 해서 부분적인 볼륨 효과가 제거되는 것은 아니며 스캔 시간이 더 길어질 수 있습니다3. 생체 외 뼈를 스캔할 때 일반적으로 쥐 뼈의 섬유주 구조를 정확하게 평가하기 위해 6-10μm의 복셀 크기가 권장됩니다. 피질 뼈에는 10-17μm의 더 큰 복셀 크기를 사용할 수 있지만 가장 작은 합리적인 복셀 크기를 사용해야 합니다. 이 프로토콜은 10μm 복셀 크기를 사용하며, 이는 주요 섬유주 특성을 구별하고 긴 스캔 시간 없이 부분 부피 효과를 최소화할 수 있을 만큼 충분히 작습니다.
뼈 조직의 높은 미네랄 밀도와 두께는 투과된 X선 에너지 스펙트럼을 크게 감쇠시키고 변화시키기 때문에 X선 에너지 및 에너지 필터 설정도 신중하게 선택해야 합니다. 일반적으로 방출된 X-선 스펙트럼은 물체(6)를 빠져나가는 스펙트럼과 동일하기 때문에, 뼈와 같은 밀도가 높은 물체에 저에너지 X-선을 사용하면 빔 경화(beam hardening)7로 알려진 인공물이 발생할 수 있다고 가정된다. 이러한 아티팩트의 발생률을 줄이기 위해 뼈 샘플을 스캔할 때 50-70kVp의 더 높은 전압이 권장됩니다5. 또한 알루미늄 또는 구리 에너지 필터를 삽입하면 보다 집중된 에너지 빔이 생성되어 아티팩트 4,7을 더욱 최소화할 수 있습니다. 이 프로토콜 전체에서 0.5mm 알루미늄 필터가 사용됩니다.
마지막으로, 스캔 회전 단계 및 회전 길이(예를 들어, 180°-360°)는 함께 캡처된 이미지의 수를 제어하며, 이는 최종 스캔(4)에서 노이즈의 양을 결정한다. 각 단계에서 여러 프레임의 평균을 내면 노이즈를 줄일 수 있지만 스캔 시간이 늘어날 수 있습니다4. 이 프로토콜은 0.7도의 회전 단계와 2의 프레임 평균을 사용합니다.
스캐닝에 대한 마지막 참고 사항: 하이드록시아파타이트 보정 팬텀은 감쇠 계수를 g/cm 35 단위의 미네랄 밀도로 변환할 수 있도록 실험용 뼈와 동일한 스캔 설정을 사용하여 스캔해야 합니다. 이 프로토콜은 0.25 g/cm3 및 0.75 g/cm3 의 하이드록시아파타이트의 팬텀을 사용하지만 다른 팬텀을 사용할 수 있습니다. 일부 스캐닝 시스템은 일상적인 시스템 보정의 일부로 내부 팬텀을 사용합니다.
스캔이 완료되면 각도 투영은 일반적으로 제조업체와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 물체의 단면 이미지로 재구성됩니다. 어떤 시스템을 사용하든 재구성 시 전체 골격을 캡처하고 골격과 비본을 인식할 수 있도록 임계값을 적절하게 설정하는 것이 중요합니다. 재구성 후에는 모든 스캔을 3차원으로 회전하여 뼈가 가로축과 일관되고 적절하게 정렬되도록 하는 것이 중요하며, 다시 제조업체의 소프트웨어를 사용해야 합니다.
회전 후, 기계적 정규화를 위한 피질 특성, 섬유주 특성 또는 파괴 형상이 필요한지 여부에 따라 분석을 위한 관심 영역(ROI)을 선택할 수 있습니다. 후자의 경우 골절 부위에서 뼈의 한쪽 끝까지의 거리를 측정하고 복셀 크기를 사용하여 스캔 파일에서 해당 슬라이스 위치를 결정하여 테스트 후 ROI를 선택해야 합니다. 선택한 영역의 길이는 100μm 이상이어야 하며, 파괴점은 ROI의 대략적인 중심에 있어야 적절한 추정치를 얻을 수 있습니다4.
ROI를 선택한 상태에서 기계적 정규화(굽힘 응력 및 변형률 계산)를 위해서는 중립 굽힘 축에서 파손이 시작된 표면까지의 최대 거리(시험 설정에 의해 결정된 장력이 가해진 표면으로 가정)와 중립축 주위의 면적 관성 모멘트(테스트 설정에 따라 다름)의 두 가지 속성이 필요합니다. 이 프로토콜은 사용자 지정 코드를 사용하여 이러한 값을 결정하는 것이 좋습니다. 코드에 액세스하려면 교신 저자에게 직접 문의하거나 https://bbml.et.iupui.edu/ 의 랩 웹 사이트를 방문하여 자세한 내용을 확인하십시오.
μCT 스캔이 완료되면 기계적 테스트를 시작할 수 있습니다. 굽힘 시험은 4점 또는 3점 구성으로 수행할 수 있습니다. 4점 굽힘 시험은 하중 지점 사이의 뼈에서 전단 응력을 제거하여 이 영역에서 순수한 굽힘이 발생할 수 있도록 하기 때문에 선호됩니다3. 그러면 뼈는 장력으로 인해 골절되어 뼈의 진정한 굽힘 특성을 더 잘 나타내는 실패를 만듭니다3. 그러나 뼈는 두 로딩 지점에서 동일한 로드를 전달하는 방식으로 로드되어야 합니다(이는 피봇팅 로딩 헤드로 촉진될 수 있음). 3점 굽힘 시험에서 하중점이 뼈와 만나는 전단 응력에 큰 변화가 있으며, 이로 인해 이 지점에서 인장3이 아닌 전단으로 인해 뼈가 파손됩니다. ASTM 표준은 굽힘을 받는 재료의 길이 대 너비 비율이 16:1이어야 하며, 이는 전단 8,9의 영향을 최소화하기 위해 지지 스팬의 길이가 뼈 너비보다 16배 더 커야 함을 의미합니다. 이것은 작은 설치류 뼈를 테스트할 때 달성이 불가능한 경우가 많기 때문에 로딩 스팬은 가능한 한 크게 만들되 단면 모양의 변화는 최대한 작게 만듭니다. 또한 4점 굽힘을 수행할 때 하부 스팬과 상부 스팬의 길이 사이의 비율은 ~3:18이어야 하며, 이는 일반적으로 경골에서 달성할 수 있지만 짧은 대퇴골에서는 어렵습니다. 또한 대퇴골의 피질 벽이 얇기 때문에 시험 중에 뼈 단면의 모양이 변하는 고리형 변형에 취약합니다(3점 굽힘에 비해 동일한 굽힘 모멘트를 유도하려면 더 큰 힘이 필요하기 때문에 4점 시험에서 강조될 수 있음). 따라서 이 프로토콜 전체에서 마우스 대퇴골에는 3점 굽힘이 사용되고 경골에는 4점 굽힘이 사용됩니다.
마지막으로, 통계 분석을 위해 연구를 적절하게 강화하는 것이 중요합니다. 기계적 테스트에 대한 일반적인 권장 사항은 일부 기계적 특성, 특히 항복 후 매개변수가 매우 가변적일 수 있으므로 차이를 감지할 수 있도록 실험 그룹당 10-12개의 뼈 표본 크기를 갖는 것입니다. 어떤 경우에는 연구 중에 발생할 수 있는 감소를 감안할 때 더 높은 동물 표본 크기로 시작하는 것을 의미할 수 있습니다. 연구를 시도하기 전에 기존 데이터를 사용한 표본 크기 분석을 완료해야 합니다.
많은 한계와 가정이 있지만, 굽힘 시험은 특히 그룹 간의 상대적 차이가 중요한 경우 매우 정확한 결과를 제공할 수 있습니다. 이러한 특성은 섬유주 구조 및 피질 형태 분석과 함께 질병 상태 및 치료 요법에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리가 통제할 수 있는 실험의 측면(예: 수집, 저장, 스캔 및 테스트)에 주의를 기울이면 정확한 결과가 생성되었다는 확신을 가질 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
스캔 및 테스트 프로세스 전반에 걸쳐 문제 해결 및 최적화가 적절한 순간이 있습니다. 첫 번째는 μCT를 사용하여 뼈를 스캔할 때 발생합니다. 많은 시스템에는 하나의 물체를 잡고 스캔할 수 있는 홀더가 함께 제공되지만 맞춤형 홀더를 제작하여 동시에 여러 뼈를 스캔할 수 있습니다. 여러 뼈를 스캔하는 것은 최적화를 위한 훌륭한 포인트가 될 수 있지만, 아티팩트가 유발되지 않도록 스캔 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜을 개발하기 위한 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)[AR072609]의 지원을 받았습니다.
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
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