Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

Summary

L’analisi meccanica delle ossa dei roditori è un metodo prezioso per estrarre informazioni sulla suscettibilità di un osso alla frattura. In mancanza di un’adeguata comprensione pratica, i risultati possono essere sovrainterpretati o non validi. Questo protocollo servirà come guida per garantire che i test meccanici vengano eseguiti in modo accurato per fornire dati validi e funzionali.

Abstract

La fragilità scheletrica che porta alla frattura è una crisi di salute pubblica americana che provoca 1,5 milioni di fratture ogni anno e 18 miliardi di dollari di costi diretti per l’assistenza. La capacità di comprendere i meccanismi alla base della malattia ossea e la risposta al trattamento non è solo auspicabile, ma fondamentale. I test meccanici dell’osso sono una tecnica preziosa per comprendere e quantificare la suscettibilità di un osso alla frattura. Sebbene questo metodo sembri semplice da eseguire, è possibile che si raggiunga conclusioni inappropriate e imprecise se le ipotesi e i passaggi chiave vengono ignorati dall’utente. Ciò è stato osservato in tutte le discipline, poiché gli studi continuano a essere pubblicati con un uso improprio dei metodi e un’interpretazione errata dei risultati. Questo protocollo servirà come base per i principi associati ai test meccanici insieme all’applicazione di queste tecniche, dalle considerazioni sulle dimensioni del campione attraverso la raccolta e la conservazione dei tessuti, all’analisi e all’interpretazione dei dati. Con questo in mano, è possibile ottenere preziose informazioni sulla suscettibilità di un osso alla frattura, favorendo la comprensione sia per la ricerca accademica che per le soluzioni cliniche.

Introduction

Il test meccanico dell’osso è il metodo principale per estrarre informazioni funzionali relative alla suscettibilità di un osso alla frattura. Negli studi preclinici, possono essere utilizzate diverse modalità di test, ma di gran lunga la più comune è la flessione delle ossa lunghe. Questi test sono facili da eseguire e possono essere utilizzati su ossa di dimensioni variabili dall’uomo al topo. Poiché i topi sono uno degli animali più comunemente studiati nella ricerca preclinica, questo protocollo si concentrerà sui test di flessione eseguiti sui femori e sulle tibie dei topi.

Prima di eseguire le prove di flessione, le ossa devono essere adeguatamente raccolte e conservate. I metodi di conservazione più comuni sono stati tradizionalmente il congelamento delle ossa in una garza imbevuta di soluzione salina, il congelamento in soluzione fisiologica da sola o la disidratazione delle ossa in etanolo ¹. È stato dimostrato che le ossa conservate in etanolo hanno una maggiore rigidità e modulo elastico e una diminuzione dei parametri di deformazione rispetto a quelle conservate congelate¹. Anche reidratare le ossa prima del test non ripristina queste proprietà ai livelli normali ¹. La conservazione immersa nella soluzione fisiologica potrebbe causare danni all’osso poiché la pressione viene esercitata mentre la soluzione salina si espande. Inoltre, sarebbe necessario uno scongelamento completo della soluzione per rimuovere le ossa per la scansione della tomografia microcomputerizzata (μCT). Di conseguenza, il congelamento delle ossa appena raccolte in garze imbevute di soluzione salina è diventato il metodo di conservazione standard ed è raccomandato in tutto questo protocollo.

Poiché le dimensioni e la forma di un osso influenzano la sua forza di massa e molti modelli di malattia alterano significativamente le dimensioni e la morfologia dell’osso, i principi ingegneristici vengono utilizzati per normalizzare gli effetti delle dimensioni per produrre proprietà che stimano il comportamento del tessuto². Questo approccio richiede la geometria della sezione trasversale della posizione del guasto, che viene più comunemente acquisita utilizzando μCT per creare scansioni delle ossa prima del test. μCT è ampiamente utilizzato grazie alla sua disponibilità e all’elevata risoluzione dell’immagine. Inoltre, i contributi dei tessuti molli non sono inclusi e la scansione non richiede fissazione chimica o altre modifiche all’osso ^3,4. In tutte le forme di TC, una sorgente di raggi X viene focalizzata su un oggetto mentre un rivelatore sull’altro lato dell’oggetto misura l’energia di raggi X risultante. Questo produce un’ombra a raggi X del campione che può essere convertita in un’immagine ^3,5. L’oggetto da scansionare viene ruotato (o la sorgente di raggi X e il rivelatore vengono ruotati attorno al campione), generando immagini che possono essere ricostruite in un set di dati tridimensionali che rappresenta l’oggetto⁵.

La risoluzione di scansione, ovvero la distanza tra due oggetti che possono essere risolti singolarmente, viene controllata modificando la dimensione nominale del voxel o la dimensione di un pixel nell’immagine risultante. È generalmente accettato che gli oggetti debbano essere almeno due volte le dimensioni di un singolo voxel per essere identificati³, ma un rapporto più alto consentirà una maggiore precisione. Inoltre, i voxel più grandi sono più inclini agli effetti di volume parziale: quando un singolo voxel contiene tessuti di densità variabile, gli viene assegnata la media di queste densità, piuttosto che la densità specifica di un singolo tessuto, il che può portare a una sovra- o sotto-stima delle aree tissutali e della densità minerale³. Sebbene questi problemi possano essere attenuati scegliendo voxel di dimensioni inferiori, l’utilizzo di una risoluzione più elevata non garantisce l’eliminazione degli effetti di volume parziale e potrebbe richiedere tempi di scansione più lunghi³. Quando si esegue la scansione delle ossa ex vivo, si raccomanda generalmente una dimensione del voxel di 6-10 μm per valutare con precisione l’architettura trabecolare delle ossa di topo. Per l’osso corticale può essere utilizzata una dimensione del voxel più grande di 10-17 μm, anche se dovrebbe essere utilizzata la dimensione del voxel più piccola e ragionevole. Questo protocollo utilizza una dimensione del voxel di 10 μm, che è abbastanza piccola da differenziare le proprietà trabecolari chiave e ridurre al minimo gli effetti del volume parziale senza lunghi tempi di scansione.

Anche le impostazioni dell’energia dei raggi X e del filtro energetico devono essere selezionate con attenzione, poiché l’elevata densità minerale e lo spessore del tessuto osseo attenuano e alterano notevolmente lo spettro di energia dei raggi X trasmessi. Si presume generalmente che, poiché lo spettro dei raggi X emessi è equivalente allo spettro che esce dall’oggetto⁶, l’uso di raggi X a bassa energia su oggetti densi come l’osso può portare a un artefatto noto come indurimento del fascio⁷. Si consiglia una tensione più elevata di 50-70 kVp durante la scansione di campioni ossei per ridurre l’incidenza di questi artefatti⁵. Inoltre, l’inserimento di un filtro energetico in alluminio o rame crea un fascio di energia più concentrato, riducendo ulteriormente gli artefatti ^4,7. In questo protocollo verrà utilizzato un filtro in alluminio da 0,5 mm.

Infine, il passo di rotazione della scansione e la lunghezza di rotazione (ad esempio, 180°-360°), insieme controllano il numero di immagini acquisite, che determina la quantità di rumore nella scansione finale⁴. La media di più fotogrammi in ogni passaggio può ridurre il rumore ma può aumentare il tempo di scansione⁴. Questo protocollo utilizza un passo di rotazione di 0,7 gradi e una media dei frame di 2.

Un’ultima nota sulla scansione: i fantocci di calibrazione dell’idrossiapatite devono essere scansionati utilizzando le stesse impostazioni di scansione delle ossa sperimentali per consentire la conversione dei coefficienti di attenuazione in densità minerale in g/cm³⁵. Questo protocollo utilizza fantocci di 0,25 g/cm3 e 0,75 g/^cm3 di idrossiapatite, sebbene siano disponibili fantocci diversi. Si noti che alcuni sistemi di scansione utilizzano fantocci interni come parte della calibrazione giornaliera del sistema.

Una volta completata la scansione, le proiezioni angolari vengono ricostruite in immagini in sezione trasversale dell’oggetto, in genere utilizzando il software in dotazione del produttore. Qualunque sia il sistema utilizzato, è importante assicurarsi che l’intero osso venga catturato nella ricostruzione e che la soglia sia impostata in modo appropriato per consentire il riconoscimento dell’osso rispetto al non osso. Dopo la ricostruzione, è fondamentale ruotare tutte le scansioni in tre dimensioni in modo che le ossa siano orientate in modo coerente e correttamente allineate con l’asse trasversale, sempre utilizzando il software del produttore.

Dopo la rotazione, le regioni di interesse (ROI) per l’analisi possono essere selezionate in base al fatto che si desiderino proprietà corticali, proprietà trabecolari o geometria della frattura per la normalizzazione meccanica. Per quest’ultimo, le ROI devono essere selezionate dopo il test misurando la distanza dal sito di frattura a un’estremità dell’osso e utilizzando la dimensione del voxel per determinare la posizione della fetta corrispondente nel file di scansione. La regione selezionata deve essere lunga almeno 100 μm, con il punto di frattura al centro approssimativo del ROI, per fornire una stima adeguata⁴.

Con i ROI selezionati, sono necessarie due proprietà per la normalizzazione meccanica (per calcolare la sollecitazione e la deformazione di flessione): la distanza massima dall’asse di flessione neutro alla superficie in cui viene avviato il cedimento (si presume che sia la superficie caricata in tensione, determinata dalla configurazione di prova) e il momento di inerzia dell’area attorno all’asse neutro (anch’esso dipendente dalla configurazione di prova). Questo protocollo consiglia l’uso di un codice personalizzato per determinare questi valori. Per accedere al codice, contattare direttamente l’autore corrispondente o visitare il sito Web del laboratorio all’indirizzo https://bbml.et.iupui.edu/ per ulteriori informazioni.

Una volta completata la scansione μCT, è possibile iniziare i test meccanici. Le prove di flessione possono essere eseguite in configurazioni a quattro o tre punti. Le prove di flessione a quattro punti sono preferite in quanto eliminano lo sforzo di taglio nell’osso tra i punti di carico, consentendo la flessione pura in questa regione³. L’osso si fratturerà quindi a causa della tensione, creando un cedimento che è più rappresentativo delle vere proprietà di flessione dell’osso³. Tuttavia, l’osso deve essere caricato in modo tale da fornire lo stesso carico in entrambi i punti di carico (questo può essere facilitato con una testa di carico girevole). Nei test di flessione a tre punti, c’è un grande cambiamento nella sollecitazione di taglio dove il punto di carico incontra l’osso, che provoca la rottura dell’osso in questo punto a causa del taglio, non della tensione³. Gli standard ASTM raccomandano che i materiali sottoposti a flessione dovrebbero avere un rapporto lunghezza-larghezza di 16:1, il che significa che la lunghezza della campata di supporto dovrebbe essere 16 volte maggiore della larghezza dell’osso per ridurre al minimo gli impatti del taglio ^8,9. Questo è spesso impossibile da ottenere quando si testano piccole ossa di roditori, quindi la campata di carico viene semplicemente resa il più grande possibile ma con il più piccolo cambiamento possibile nella forma della sezione trasversale. Inoltre, quando si esegue la flessione a quattro punti, il rapporto tra le lunghezze della campata inferiore e superiore dovrebbe essere ~3:1⁸, che di solito può essere raggiunto nella tibia, ma è difficile nel femore più corto. Inoltre, le pareti corticali più sottili dei femori li rendono suscettibili alla deformazione ad anello che cambia la forma della sezione trasversale dell’osso durante il test (questo può essere accentuato nei test a quattro punti poiché è necessaria una forza maggiore per indurre lo stesso momento flettente rispetto alla flessione a tre punti). Pertanto, la flessione a tre punti verrà utilizzata per i femori di topo mentre la flessione a quattro punti verrà utilizzata per le tibie in tutto questo protocollo.

Infine, è importante alimentare adeguatamente lo studio per l’analisi statistica. Una raccomandazione generale per i test meccanici è quella di avere una dimensione del campione di 10-12 ossa per gruppo sperimentale per essere in grado di rilevare le differenze, poiché alcune proprietà meccaniche, in particolare i parametri post-rendimento, possono essere molto variabili. In alcuni casi, ciò può significare iniziare con un campione di animali di dimensioni più elevate, dato l’attrito che potrebbe verificarsi durante lo studio. L’analisi della dimensione del campione utilizzando i dati esistenti deve essere completata prima di tentare uno studio.

Ci sono numerose limitazioni e ipotesi, ma i test di flessione possono fornire risultati abbastanza accurati, soprattutto quando le differenze relative tra i gruppi sono di interesse. Queste proprietà, insieme all’analisi dell’architettura trabecolare e della morfologia corticale, possono fornire una migliore comprensione degli stati patologici e dei regimi di trattamento. Se si presta attenzione a quegli aspetti dell’esperimento che sono sotto il nostro controllo (ad esempio, la raccolta, la conservazione, la scansione e il test), possiamo essere sicuri che siano stati generati risultati accurati.

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo che coinvolgono animali sono state approvate dall’Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) prima della procedura. Gli animali descritti nella procedura sono stati soppressi tramite inalazione di CO2seguita da lussazione cervicale come mezzo secondario di eutanasia. 1. Raccolta, conservazione e scongelamento delle ossa Raccolta e stoccaggioPosiziona il mouse…

Representative Results

Al termine della scansione TC, la maggior parte delle scansioni inadeguate può essere rilevata nella ricostruzione. Spesso, le scansioni scadenti avranno un’elevata compensazione del disallineamento che è un chiaro indicatore di un errore durante la scansione. Tuttavia, possono verificarsi errori in altri passaggi e potrebbero anche portare a dati imprecisi. Questi errori possono spesso essere individuati durante l’esame delle singole proprietà architettoniche calcolate. Se i valori sono molto al di fuori dell’interva…

Discussion

Durante il processo di scansione e test, ci sono momenti in cui la risoluzione dei problemi e l’ottimizzazione sono appropriate. Il primo di questi si verifica quando si esegue la scansione delle ossa utilizzando μCT. Mentre molti sistemi sono dotati di un supporto in cui un oggetto può essere tenuto e scansionato, i supporti personalizzati possono essere fabbricati per scansionare più ossa contemporaneamente. La scansione di più ossa può essere un ottimo punto per l’ottimizzazione, ma è necessario prestare attenzi…

Materials

CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object