Her presenterer vi en protokoll for å isolere og identifisere de menneskelige limbale nisjecellene.
Her rapporterer vi en standard prosedyre for isolering og identifisering av limbale nisjeceller (LNC). Limbusvev hentet fra en øyebank ble brukt til LNCs isolasjon. Vevet ble delt inn i 12 stykker under aseptiske forhold og fordøyd i 18 timer ved 37 °C i cellekulturinkubatoren ved bruk av kollagenase A for å oppnå celleklynger med LNC og limbale epiteliale stamceller. Celleklyngene ble videre fordøyd i 15 minutter ved 37 °C ved bruk av 0,25 % trypsin-EDTA for å oppnå enkeltceller og deretter dyrket i modifisert embryonalt stamcellemedium (MESCM) på en plastoverflate belagt med 5 % Matrigel. Cellene ble passert ved 70% konfluens, og LNCs ble identifisert ved hjelp av immunfluorescens, sanntids kvantitativ PCR (qPCR) og flowcytometri. Primære LNCer ble isolert og passert mer enn 12 ganger. Spredningsaktiviteten av LNCs fra P4 til P6 var den høyeste. LNC uttrykte høyere stamcellemarkører enn BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR og PDGFRβ). Videre viste resultatene at P4 LNC uttrykte VIM, CD90, CD105 og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, som kunne brukes som en markør for identifisering av LNC. Flowcytometrisk analyse viste at ca. 95 %, 97 %, 92 % og 11 % av LNC uttrykte henholdsvis CD73, CD90, CD105 og SCF, mens de var 68 %, 99 %, 20 % og 3 % i BMMSC. Standardprosessen for LNC-isolering og identifisering kan gi et pålitelig laboratoriegrunnlag for utstrakt bruk av LNC.
Forekomsten av hornhinneepitelial stamcellemangel (CESD), også kalt limbal stamcellemangel (LSCD)1, og hornhinneepitelial regenerering (CES) blir mer og mer presserende på grunn av hornhinneinfeksjon og skade. Hvis ikke riktig behandlet, kan CESD føre til blindhet som krever hornhinnetransplantasjon. Som et resultat blir CES-regenerering stadig viktigere. Det er en gruppe støttende celler kalt limbale nisjeceller (LNC) som gir viktig støtte til CES-funksjonen. Limbale stromale stamceller ble først isolert av Polisetty et al.2 og identifisert av Xie et al.3 som LNCer som er lokalisert i limbalepitelet subjacent og stroma i limbus. LNC er den viktigste støttende stamcellen i hornhinnen, og med funksjonen av benmargsavledet MSC (BMMSC), og kan induseres til å utvikle seg til hornhinneepitelceller og hornhinnestromale celler, etc.3,4,5,6,7. Tidligere studier viste at stamcellekvalitetene til LNC er mer primitive enn BMMSC8, som allerede er mye brukt i klinikken. LNC kan til og med bli det neste levedyktige alternativet etter MSC, spesielt for behandling av CESD. Som viktige støtteceller for CES er LNC også stamceller avledet fra “nisje” -strukturen i limbus. LNC kan spille en nøkkelrolle i dedifferensiering av modne hornhinneepitelceller (MCEC) til CES9. Imidlertid er studier på LNC fortsatt relativt utilstrekkelige, og det er ingen konsensus om terminologi, isolasjon, rensing, identifikasjon og egenskaper ved LNC. Noen forskere har kalt LNCs limbale biopsi-avledede stromale stamceller 10, limbale mesenkymale stamceller 11, limbale fibroblast stamceller12 og limbale mesenkymale stromale celler13. Siden vekstegenskapene til LNC ikke er beskrevet i detalj, og på grunn av deres lovende vitenskapelige og kliniske anvendelser, og kan være et av de viktigste kliniske verktøyene i fremtiden, er det nødvendig å oppsummere isolasjon, rensing, identifikasjon og egenskaper av LNC.
Ifølge en tidligere studie14 er LNC hovedsakelig tilstede ved limbalepitelet subjacent og stroma i limbus. Denne protokollen inkluderer behandling av limbusvev ved bruk av kollagenase A, oppnå en klynge bestående av LEPC og LNC, og fordøye den i enkeltceller med 0,25% trypsin-EDTA (TE). LNC ble deretter selektivt dyrket i et modifisert embryonalt stamcellemedium (MESCM) for å bli renset. Protokollen rapportert i denne artikkelen er enkel og har høy effektivitet i å skaffe menneskelige LNCs i store mengder.
Den detaljerte prosedyren for LNC-isolasjon, kultur og identifikasjon ble registrert i videoen for forskere som er interessert i LNC-studien, og det kan enkelt gjentas når det er nødvendig.
Korneal gjennomsiktighet opprettholdes vanligvis ved regelmessig arrangement og distribusjon av små fibre (25-30 nm i diameter) i hornhinnen stroma, noe som er avgjørende for normal synsstyrke16. Det er 253 millioner synshemmede over hele verden, hvorav 36 millioner er blinde17. Verdens helseorganisasjon (WHO) anser hornhindeblindhet som en av de alvorligste farene for menneskelig syn, og står for 5.1% av all blindhet over hele verden16. Defekt i …
The authors have nothing to disclose.
Takk til Wei Wang, Lingjuan Xu og Rong Liu for veiledningen i dette arbeidet, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You og Li Guigang for å gi noe av materialet, Guanyu Su for å skrive manuskriptet, Xiao Zhou, Yihong Xiong og Huatao Xie for å korrigere manuskriptet, og Guigang Li for hans fulle veiledning. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 82070936, 81470606, 81570819), Hubei-provinsen helse og familieplanlegging vitenskapelig forskningsprosjekt (nr. WJ2017M073), Topp ti translasjonelle medisinske forskningsprosjekter fra Tongji Hospital (No.2016ZHYX20), Opplæringsprosjekt for unge medisinske pionerer i Wuhan City (No.2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), National Health Commission of Hubei Province-prosjektet i 2022(WJ2021ZH0005), og Subject Construction Foundation of Finance Department of Hubei In 2022(42000022815T000000102)
4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |