Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben
Summary
Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.
Abstract
Auf Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) basierende Ansätze haben sich als leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Nesseltier-Dinoflagellaten-Symbiose aufzuklären und wie Korallen auf Stress reagieren (z. B. während der temperaturinduzierten Bleiche). Das Steady-State-Metaboliten-Profiling des Korallen-Holobionten, der den Nesseltierwirt und seine assoziierten Mikroben (Symbiodiniaceae und andere Protisten, Bakterien, Archaeen, Pilze und Viren) umfasst, wurde erfolgreich unter Umgebungs- und Stressbedingungen angewendet, um den ganzheitlichen Stoffwechselstatus der Koralle zu charakterisieren.
Um die Fragen rund um die symbiotischen Interaktionen zu beantworten, ist es jedoch notwendig, die Metabolitenprofile des Korallenwirts und seiner Algensymbionten unabhängig voneinander zu analysieren, was nur durch eine physikalische Trennung und Isolierung der Gewebe erreicht werden kann, gefolgt von einer unabhängigen Extraktion und Analyse. Während die Anwendung der Metabolomik im Korallenbereich relativ neu ist, haben die anhaltenden Bemühungen von Forschungsgruppen zur Entwicklung robuster Methoden zur Analyse von Metaboliten in Korallen geführt, einschließlich der Trennung des Korallenwirtsgewebes und der Algensymbionten.
In diesem Artikel wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Holobiontentrennung und die Extraktion von Metaboliten für die GC-MS-Analyse vorgestellt, einschließlich der wichtigsten Optimierungsschritte, die in Betracht gezogen werden sollten. Wir zeigen, dass das kombinierte Metabolitenprofil der beiden Fraktionen (Koralle und Symbiodiniaceae) nach unabhängiger Analyse dem Profil des Ganzen (Holobiont) ähnelt, aber durch die Trennung der Gewebe können wir auch wichtige Informationen über den Stoffwechsel und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Partnern erhalten, die aus dem Ganzen allein nicht gewonnen werden können.
Introduction
Metaboliten stellen die Endprodukte zellulärer Prozesse dar, und die Metabolomik – die Untersuchung der von einem bestimmten Organismus oder Ökosystem produzierten Metaboliten – kann ein direktes Maß für die Funktionsweise von Organismen liefern1. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Ökosystemen, symbiotischen Interaktionen und Wiederherstellungswerkzeugen, da das Ziel der meisten Managementstrategien darin besteht, bestimmte Ökosystemdienstleistungen zu erhalten (oder wiederherzustellen)2. Korallenriffe sind ein aquatisches Ökosystem, das den potenziellen Wert der Metabolomik für die Aufklärung symbiotischer Interaktionen und die Verknüpfung von korallenphysiologischen Reaktionen mit Auswirkungen auf Gemeinde- und Ökosystemebene demonstriert3. Die Anwendung der Hochdurchsatz-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wird besonders geschätzt, da sie in der Lage ist, ein breites Spektrum von Metabolitenklassen gleichzeitig mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit schnell zu analysieren, eine schnelle Identifizierung von Verbindungen zu ermöglichen, wenn Spektralbibliotheken verfügbar sind, und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei relativ niedrigen Kosten pro Probe zu bieten.
Korallen sind Holobionten, die aus dem Korallentier, photosynthetischen Dinoflagellaten-Endosymbionten (Familie: Symbiodiniaceae4) und einem komplexen Mikrobiombestehen 5,6. Insgesamt wird die Fitness des Holobionten vor allem durch den Austausch von kleinen Molekülen und Elementen aufrechterhalten, um die Stoffwechselfunktion jedes Mitglieds zu unterstützen 7,8,9,10. Metabolomische Ansätze haben sich als besonders leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Symbiosespezifität9,11, der Bleichreaktion auf thermischen Stress 7,8,12,13, der Krankheitsreaktionen 14, der Reaktionen auf Umweltverschmutzung 15, der Photoakklimatisierung 16 und der chemischen Signalgebung 17 in Korallen aufzuklären sowie die Entdeckung von Biomarkern zu unterstützen 18,19. Darüber hinaus kann die Metabolomik eine wertvolle Bestätigung für die Schlussfolgerungen liefern, die aus DNA- und RNA-basierten Techniken abgeleitet werden 9,20. Es besteht daher ein erhebliches Potenzial für den Einsatz der Metabolomik zur Bewertung der Gesundheit von Riffen und zur Entwicklung von Instrumenten für den Schutz von Riffen3, z. B. durch den Nachweis metabolischer Biomarker für Stress18,19 und für die Untersuchung des Potenzials aktiver Managementstrategien wie Ernährungssubventionen21.
Die Trennung der Wirts- und Symbiontenzellen und die Analyse ihrer Metabolitenprofile unabhängig voneinander und nicht zusammen wie der Holobiont kann mehr Informationen über die Partnerinteraktionen, den unabhängigen physiologischen und metabolischen Status und die potenziellen molekularen Mechanismen für die Anpassung liefern 11,12,22,23,24. Ohne die Koralle und die Symbiodiniaceae zu trennen, ist es fast unmöglich, den Beitrag und den Stoffwechsel von Korallen und/oder Symbiodiniaceae unabhängig voneinander aufzuklären, außer mit komplexer Genomrekonstruktion und metabolischer Modellierung25, aber dies muss noch auf die Korallen-Dinoflagellaten-Symbiose angewendet werden. Darüber hinaus kann der Versuch, Informationen über den individuellen Stoffwechsel des Wirts oder Algensymbionten aus dem Metabolitenprofil des Holobionten zu extrahieren, zu Fehlinterpretationen führen.
Zum Beispiel wurde bis vor kurzem angenommen, dass das Vorhandensein von mehrfach ungesättigten C18:3n-6-, C18:4n-3- und C16-Fettsäuren in Extrakten aus Korallen- und Holobiongewebe vom Algensymbionten stammt, da man davon ausging, dass Korallen nicht die für die Produktion von Omega-3 (ω3)-Fettsäuren essentiellen ωx-Desaturasen besitzen; Neuere genomische Beweise deuten jedoch darauf hin, dass mehrere Nesseltiere die Fähigkeit haben, ω3-PUFA de novo zu produzieren und ω3-langkettiges PUFA26 weiter zu biosynthetisieren. Die Kombination von GC-MS mit stabiler Isotopenmarkierung (z. B. 13 C-Bicarbonat, NaH13CO 3) kann verwendet werden, um das Schicksal von photosynthetisch fixiertem Kohlenstoff durch holobionte Stoffwechselnetzwerke von Korallen sowohl unter Kontrollbedingungen als auch als Reaktion auf externe Stressoren zu verfolgen27,28. Ein kritischer Schritt bei der Verfolgung des 13-C-Schicksals ist jedoch die Trennung des Korallengewebes von den Algenzellen – nur dann kann das Vorhandensein einer 13-C-markiertenVerbindung in der Korallenwirtsfraktion eindeutig als von Symbiodiniaceae abgeleiteter Metabolit, der in die Koralle transloziert wurde, oder als nachgeschaltetes Produkt einer translozierten markierten Verbindung zugeordnet werden. Diese Technik hat ihre Leistungsfähigkeit unter Beweis gestellt, indem sie die lang gehegte Annahme in Frage stellte, dass Glycerin die primäre Form ist, in der Photosynthese vom Symbionten zum Wirt transloziertwird 29, und indem sie aufklärte, wie sich der Nährstofffluss zwischen den Partnern während des Bleichens27,28 und als Reaktion auf inkompatible Symbiodiniaceae-Arten verändert11.
Während die Entscheidung, Gewebe zu trennen, in erster Linie von der Forschungsfrage bestimmt wird, sind die Praktikabilität, Zuverlässigkeit und potenziellen metabolischen Auswirkungen dieses Ansatzes wichtig zu berücksichtigen. Hier stellen wir detaillierte, demonstrierte Methoden zur Extraktion von Metaboliten aus dem Holobionten, sowie den getrennten Wirts- und Symbiontenfraktionen vor. Wir vergleichen die Metabolitenprofile des Wirts und des Symbionten unabhängig voneinander und wie diese Profile mit dem holobionten Metabolitenprofil verglichen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Trennung von Wirt und Symbiont ist durch einfache Zentrifugation leicht und schnell zu erreichen, und die Ergebnisse hier zeigen, dass die Trennung der Fraktionen wertvolle Informationen liefern kann, die auf spezifische Beiträge von Holobiontenmitgliedern hinweisen, die zur funktionellen Analyse der Korallengesundheit beitragen können. In erwachsenen Korallen wird die Lipidsynthese hauptsächlich vom ansässigen Algensymbionten 40 durchgeführt, der Lipide (z. B. Triacylglycerin und Phospholipide)41 und F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. wurde durch ein Forschungsstipendium des UTS-Kanzlers unterstützt.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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