가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학
Summary
여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.
Abstract
가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS) 기반 접근법은 자포동물-와편모충 공생의 대사 기초와 산호가 스트레스에 어떻게 반응하는지(즉, 온도로 인한 표백 중)를 설명하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 자포동물 숙주와 관련 미생물(Symbiodiniaceae 및 기타 원생생물, 박테리아, 고세균, 곰팡이 및 바이러스)로 구성된 산호 홀로비온트의 정상 상태 대사 산물 프로파일링은 산호의 전체적인 대사 상태를 특성화하기 위해 주변 및 스트레스 조건에서 성공적으로 적용되었습니다.
그러나 공생 상호 작용을 둘러싼 질문에 답하려면 산호 숙주와 조류 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 분석해야 하며, 이는 조직의 물리적 분리 및 분리에 의해서만 달성될 수 있으며 독립적인 추출 및 분석이 뒤따릅니다. 대사체학의 적용은 산호 분야에서 비교적 새로운 것이지만, 연구 그룹의 지속적인 노력으로 산호 숙주 조직과 조류 공생체의 분리를 포함하여 산호의 대사 산물을 분석하는 강력한 방법이 개발되었습니다.
이 백서는 고려해야 할 주요 최적화 단계를 포함하여 GC-MS 분석을 위한 홀로비온트 분리 및 대사 산물 추출에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 우리는 일단 독립적으로 분석되면 두 분획(산호 및 공생충과)의 결합된 대사 산물 프로필이 전체(홀로비온트)의 프로필과 유사하지만 조직을 분리함으로써 전체만으로는 얻을 수 없는 두 파트너의 대사 및 상호 작용에 대한 주요 정보를 얻을 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
대사 산물은 세포 과정의 최종 산물을 나타내며, 대사체학(metabolomics)은 특정 유기체 또는 생태계에서 생산되는 대사 산물 모음에 대한 연구로 유기체 기능의 직접적인 측정을 제공할 수 있습니다1. 이는 생태계, 공생적 상호작용 및 복원 도구를 탐색하는 데 특히 중요한데, 대부분의 관리 전략의 목표는 특정 생태계 서비스 기능을 보존(또는 복원)하는 것이기 때문이다2. 산호초는 공생적 상호작용을 규명하고 산호의 생리적 반응을 군집 수준 및 생태계 수준의 영향과 연결하기 위한 대사체학의 잠재적 가치를 보여주는 하나의 수생 생태계이다3. 고처리량 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)의 응용 분야는 높은 선택성과 감도로 광범위한 대사산물 클래스를 동시에 신속하게 분석하고, 스펙트럼 라이브러리를 사용할 수 있을 때 신속한 화합물 식별을 제공하며, 상대적으로 낮은 시료당 비용으로 높은 수준의 재현성과 정확도를 제공할 수 있기 때문에 특히 가치가 있습니다.
산호는 산호 동물, 광합성 와편모충 내공생체(과: Symbiodiniaceae4) 및 복잡한 마이크로바이옴 5,6으로 구성된 홀로비온트입니다. 전반적으로, 홀로비온트의 적합성은 주로 각 구성원의 대사 기능을 지원하기 위해 작은 분자와 요소의 교환을 통해 유지된다 7,8,9,10. 대사체학 접근법은 산호의 공생 특이성(symbiosis specificity)9,11, 열 스트레스에 대한 표백 반응(bleaching response)7,8,12,13, 질병 반응(disease response)14, 오염 노출 반응(pollution exposure response)15, 광순응(photo-aclimation)16 및 화학적 신호전달(chemical signalling)17의 대사 기초를 밝히고 바이오마커 발견(biomarker discovery)18을 돕는 데 특히 강력한 것으로 입증되었다,19. 또한, 대사체학은 DNA 및 RNA 기반 기술에서 추론된 결론에 대한 귀중한 확인을 제공할 수 있습니다 9,20. 따라서 스트레스의 대사 바이오마커 검출18,19 및 영양 보조금 21과 같은 적극적인 관리 전략의 잠재력을 조사하는 것과 같이 산호초의 건강을 평가하고 산호초 보존을 위한 도구를 개발하기 위해 대사체학을 사용할 수 있는 상당한 잠재력이 있다21.
숙주 세포와 공생 세포를 분리하고 홀로비온트로 함께 하지 않고 독립적으로 대사 산물 프로파일을 분석하면 파트너 상호 작용, 독립적인 생리학적 및 대사 상태, 적응을 위한 잠재적 분자 메커니즘에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다 11,12,22,23,24. 산호와 공생충과(Symbiodiniaceae)를 분리하지 않고, 복잡한 게놈 재구성 및대사 모델링을 제외하고는 산호 및/또는 공생충과(Symbiodiniaceae)의 기여와 신진대사를 독립적으로 설명하는 것은 거의 불가능하지만, 이는 산호-와편모충 공생에 아직 적용되지 않았다. 또한, 홀로비온트의 대사 산물 프로필에서 숙주 또는 조류 공생체의 개별 대사에 대한 정보를 추출하려고 시도하면 오해가 발생할 수 있습니다.
예를 들어, 최근까지, 산호 및 홀로비온트 조직으로부터의 추출물에서 C18:3n-6, C18:4n-3 및 C16 고도불포화 지방산의 존재는 조류 공생체로부터 유래된 것으로 생각되었는데, 이는 산호가 오메가-3(ω3) 지방산의 생산에 필수적인 ωx 탈포화효소를 가지고 있지 않다고 가정했기 때문이다. 그러나, 최근의 게놈 증거에 의하면, 다수의 자포동물은 ω3 PUFA de novo를 생산하고 ω3 장쇄 PUFA26을 추가로 생합성할 수 있는 능력을 가지고 있다. GC-MS를 안정 동위원소 표지(예: 13C-중탄산염, NaH 13CO3)와결합하면 제어 조건과 외부 스트레스 요인에 대한 반응으로 산호 홀로비온트 대사 네트워크를 통해 광합성으로 고정된 탄소의 운명을 추적하는 데 사용할 수 있습니다27,28. 그러나, 13 C 운명의 추적에 있는 긴요한 단계는 조류 세포에서 산호 조직의 분리이다 그 때 산호 숙주 분획에 있는 13C 표지된 화합물의 존재는 산호에 전이된 Symbiodiniaceae 파생한 대사 산물 또는 전위된 레테르를 붙인 화합물의 하류 제품으로 명백하게 할당될 수 있다. 이 기술은 글리세롤이 광합성이 공생체에서 숙주로 전위되는 주요 형태라는 오랜 가정에 도전하고(29), 표백27,28 및 양립할 수 없는 Symbiodiniaceae 종11에 대한 반응으로 파트너 간 영양 플럭스가 어떻게 변하는지 설명함으로써 그 힘을 입증했습니다.
조직을 분리하는 결정은 주로 연구 질문에 의해 결정되지만, 이 접근법의 실용성, 신뢰성 및 잠재적인 대사 영향을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에서는 홀로비온트에서 대사 산물을 추출하기 위한 상세하고 입증된 방법과 별도의 숙주 및 공생체 분획을 제공합니다. 우리는 숙주와 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 비교하고 이러한 프로필이 홀로비온트 대사 산물 프로필과 어떻게 비교되는지 비교합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
숙주와 공생체의 분리는 간단한 원심분리를 통해 쉽고 빠르게 달성할 수 있으며, 여기의 결과는 분획을 분리하는 것이 특정 홀로비온트 구성원 기여를 나타내는 귀중한 정보를 제공할 수 있음을 보여주며, 이는 산호 건강의 기능적 분석에 기여할 수 있습니다. 성체 산호에서, 지질 합성은 주로 상주 조류 공생체(40)에 의해 수행되는데, 이 공생체는 지질(예를 들어, 트리아실글리세롤 및 인?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M.은 UTS Chancellor’s Research Fellowship의 지원을 받았습니다.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
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