Gasskromatografi-massespektrometri-basert målrettet metabolomikk av harde korallprøver

Summary

Her presenterer vi ekstraksjon og fremstilling av polare og semipolare metabolitter fra en korallholobiont, samt separert korallvertsvev og Symbiodiniaceae-cellefraksjoner, for gasskromatografi-massespektrometrianalyse.

Abstract

Gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) -baserte tilnærminger har vist seg å være kraftige for å belyse det metabolske grunnlaget for cnidar-dinoflagellatsymbiosen og hvordan koraller reagerer på stress (dvs. under temperaturindusert bleking). Steady-state metabolittprofilering av korallholobiont, som består av cnidarian verten og tilhørende mikrober (Symbiodiniaceae og andre protister, bakterier, archaea, sopp og virus), har blitt vellykket brukt under omgivelses- og stressforhold for å karakterisere korallens holistiske metabolske status.

For å svare på spørsmål rundt symbiotiske interaksjoner, er det imidlertid nødvendig å analysere metabolittprofilene til korallverten og dens algesymbionter uavhengig, noe som kun kan oppnås ved fysisk separasjon og isolering av vevet, etterfulgt av uavhengig ekstraksjon og analyse. Mens anvendelsen av metabolomikk er relativt ny for korallfeltet, har vedvarende innsats fra forskningsgrupper resultert i utvikling av robuste metoder for å analysere metabolitter i koraller, inkludert separasjon av korallvertsvev og algesymbionter.

Denne artikkelen presenterer en trinnvis veiledning for holobiontseparasjon og ekstraksjon av metabolitter for GC-MS-analyse, inkludert viktige optimaliseringstrinn for vurdering. Vi demonstrerer hvordan, når den er analysert uavhengig, er den kombinerte metabolittprofilen til de to fraksjonene (korall og Symbiodiniaceae) lik profilen til hele (holobiont), men ved å separere vevene, kan vi også få nøkkelinformasjon om metabolismen av og interaksjoner mellom de to partnerne som ikke kan oppnås fra helheten alene.

Introduction

Metabolitter representerer sluttproduktene av cellulære prosesser, og metabolomics – studiet av suiten av metabolitter produsert av en gitt organisme eller økosystem – kan gi et direkte mål på organismefunksjon¹. Dette er spesielt viktig for å utforske økosystemer, symbiotiske interaksjoner og restaureringsverktøy, da målet med de fleste forvaltningsstrategier er å bevare (eller gjenopprette) spesifikke økosystemtjenestefunksjoner². Korallrev er et akvatisk økosystem som demonstrerer den potensielle verdien av metabolomikk for å belyse symbiotiske interaksjoner og knytte korallfysiologiske responser til virkninger på samfunnsnivå og økosystemnivå³. Anvendelsen av gasskromatografi-massespektrometri med høy gjennomstrømning (GC-MS) er spesielt verdsatt på grunn av dens evne til raskt å analysere et bredt spekter av metabolittklasser samtidig med høy selektivitet og følsomhet, gi rask identifikasjon av forbindelser når spektralbiblioteker er tilgjengelige, og gi et høyt nivå av reproduserbarhet og nøyaktighet, med en relativt lav kostnad per prøve.

Koraller er holobionter som består av koralldyret, fotosyntetiske dinoflagellatendosymbionter (familie: Symbiodiniaceae⁴), og et komplekst mikrobiom ^5,6. Samlet sett opprettholdes holobiontens egnethet primært gjennom utveksling av små molekyler og elementer for å støtte den metabolske funksjonen til hvert medlem 7,8,9,10. Metabolomiske tilnærminger har vist seg spesielt kraftige for å belyse det metabolske grunnlaget for symbiosespesifisitet^9,11, blekingsresponsen på termisk stress 7,8,12,13, sykdomsresponser 14, forurensningseksponeringsresponser 15, fotoakklimatisering 16 og kjemisk signalering 17 i koraller^, samt hjelpe til med biomarkøroppdagelse ^18,19. I tillegg kan metabolomikk gi verdifull bekreftelse på konklusjonene utledet fra DNA- og RNA-baserte teknikker ^9,20. Det er derfor et betydelig potensial for bruk av metabolomics for å vurdere revets helse og utvikle verktøy for bevaring av rev³, for eksempel gjennom påvisning av metabolske biomarkører for stress^18,19 og for å undersøke potensialet for aktive forvaltningsstrategier som ernæringssubsidier²¹.

Å separere verts- og symbiontcellene og analysere deres metabolittprofiler uavhengig, i stedet for sammen som holobiont, kan gi mer informasjon om partnerinteraksjonene, uavhengige fysiologiske og metabolske statuser og potensielle molekylære mekanismer for tilpasning 11,12,22,23,24. Uten å skille koraller og Symbiodiniaceae, er det nesten umulig å belyse bidraget og metabolismen av koraller og / eller Symbiodiniaceae uavhengig, bortsett fra med kompleks genomrekonstruksjon og metabolsk modellering²⁵, men dette har ennå ikke blitt brukt på korall-dinoflagellatsymbiosen. Videre kan forsøk på å trekke ut informasjon om den individuelle metabolismen til verten eller algesymbionten fra metabolittprofilen til holobionten føre til feiltolkning.

For eksempel, inntil nylig, ble tilstedeværelsen av C18: 3n-6, C18: 4n-3 og C16 flerumettede fettsyrer i ekstrakter fra koraller og holobiont vev antatt å være avledet fra algesymbioten, da koraller ble antatt å ikke ha ωx desaturaser som er essensielle for produksjon av omega-3 (ω3) fettsyrer; Nylige genomiske bevis tyder imidlertid på at flere nesledyr har evnen til å produsere ω3 PUFA de novo og videre biosyntetisere ω3 langkjedede PUFA²⁶. Kombinere GC-MS med stabil isotopmerking (f.eks. 13 C-bikarbonat, NaH ¹³CO 3) kanbrukes til å spore skjebnen til fotosyntetisk fast karbon gjennom korallholobiont metabolske nettverk under både kontrollforhold og som svar på eksterne stressorer^27,28. Imidlertid er et kritisk skritt i sporingen av 13 C-skjebnen separasjonen av korallvevet fra algecellene – først da kan tilstedeværelsen av en ¹³C-merket forbindelse i korallvertsfraksjonen utvetydig tildeles som en Symbiodiniaceae-avledet metabolitt translokalisert til korallen eller et nedstrømsprodukt av en translokalisert merket forbindelse. Denne teknikken har vist sin kraft ved å utfordre den langvarige antagelsen om at glyserol er den primære formen der fotosyntat overføres fra symbiont til vert²⁹, samt å belyse hvordan ernæringsfluks mellom partnere endres under bleking^27,28 og som svar på inkompatible Symbiodiniaceae-arter¹¹.

Mens beslutningen om å skille vev primært drives av forskningsspørsmålet, er praktisk, pålitelighet og potensielle metabolske virkninger av denne tilnærmingen viktig å vurdere. Her gir vi detaljerte, demonstrerte metoder for ekstraksjon av metabolitter fra holobiont, samt separate verts- og symbiontfraksjoner. Vi sammenligner metabolittprofilene til verten og symbionten uavhengig av hverandre og hvordan disse profilene er sammenlignet med holobiont-metabolittprofilen.

Protocol

MERK: Den eksperimentelle designen, prøveinnsamlingen og lagringen er beskrevet i detalj andre steder 2,30,31. Tillatelse til innsamling av ville koraller må innhentes før innsamling og eksperimentering. Prøvene her ble samlet inn fra kolonier av Montipora mollis (grønn fargemorf) importert fra Batavia Coral Farms (Geraldton, WA), opprinnelig samlet inn fra et rev utenfor Abrohlosøyene (Western Australia; 28°52’4…

Representative Results

Alle data som produseres under dette arbeidet er tilgjengelige i tilleggsinformasjonen. Host-symbiont separasjon Figur 1: Oppsett og validering av separasjon av korallvertsvev og Symbiodiniaceae-celler. (A) Luftpistoloppsettet for fjerning av korallvev fra kora…

Discussion

Separasjonen av verten og symbionten er enkelt og raskt oppnåelig via enkel sentrifugering, og resultatene her viser at separasjon av fraksjonene kan gi verdifull informasjon som indikerer spesifikke holobiontmedlemsbidrag, noe som kan bidra til funksjonell analyse av korallhelse. I voksne koraller utføres lipidsyntese primært av den fastboende algesymbionten⁴⁰, som leverer lipider (f.eks. triacylglycerol og fosfolipider)41 og fettsyrer som kan fremme stressrestitusjon <sup class="xref…

Materials

100% LC-grade methanol	Merck	439193	LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads	Merck	G1152	This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford reagent	Merck	B6916	Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun	Ozito	6270636	Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine	Merck	605514/ 600148	Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate	Merck	CLS3614
Glass scintillation vials	Merck	V7130	20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G	Merck	56834	if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer		v4
R		v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software		v3.6
Sodium Hydroxide	Merck	S5881	Pellets to make 1 M solution
tidyverse		v1.3.1	R package
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate	Greiner	M3812
Whirl-Pak sample bag	Merck	WPB01018WA	Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread