Aqui, apresentamos a extração e preparação de metabólitos polares e semipolares de um holobionte de coral, bem como tecido hospedeiro coral separado e frações celulares de Symbiodiniaceae, para análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
Abordagens baseadas em cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS) provaram ser poderosas para elucidar a base metabólica da simbiose cnidário-dinoflagelado e como os corais respondem ao estresse (isto é, durante o branqueamento induzido pela temperatura). O perfil de metabólitos em estado estacionário do holobionte do coral, que compreende o hospedeiro cnidário e seus micróbios associados (Symbiodiniaceae e outros protistas, bactérias, arqueias, fungos e vírus), tem sido aplicado com sucesso sob condições ambientais e de estresse para caracterizar o estado metabólico holístico do coral.
No entanto, para responder às questões que envolvem as interações simbióticas, é necessário analisar os perfis de metabólitos do hospedeiro coral e seus simbiontes algais de forma independente, o que só pode ser alcançado pela separação física e isolamento dos tecidos, seguido de extração e análise independentes. Embora a aplicação da metabolômica seja relativamente nova no campo dos corais, os esforços sustentados de grupos de pesquisa resultaram no desenvolvimento de métodos robustos para analisar metabólitos em corais, incluindo a separação do tecido hospedeiro dos corais e dos simbiontes algais.
Este artigo apresenta um guia passo-a-passo para a separação de holobiontes e a extração de metabólitos para análise de CG-EM, incluindo os principais passos de otimização para consideração. Demonstramos como, uma vez analisado independentemente, o perfil combinado de metabólitos das duas frações (coral e Symbiodiniaceae) é semelhante ao perfil do todo (holobionte), mas separando os tecidos, também podemos obter informações importantes sobre o metabolismo e as interações entre os dois parceiros que não podem ser obtidas do todo isoladamente.
Metabólitos representam os produtos finais dos processos celulares, e a metabolômica – o estudo do conjunto de metabólitos produzidos por um determinado organismo ou ecossistema – pode fornecer uma medida direta do funcionamento do organismo1. Isso é particularmente crítico para explorar ecossistemas, interações simbióticas e ferramentas de restauração, já que o objetivo da maioria das estratégias de manejo é preservar (ou restaurar) funções específicas de serviços ecossistêmicos2. Os recifes de coral são um ecossistema aquático que demonstra o valor potencial da metabolômica para elucidar interações simbióticas e ligar as respostas fisiológicas dos corais aos impactos em nível de comunidade e ecossistema3. A aplicação de cromatografia gasosa de alto rendimento-espectrometria de massas (GC-MS) é especialmente valorizada devido à sua capacidade de analisar rapidamente uma ampla gama de classes de metabólitos simultaneamente com alta seletividade e sensibilidade, fornecer rápida identificação de compostos quando bibliotecas espectrais estão disponíveis e fornecer um alto nível de reprodutibilidade e precisão, com um custo relativamente baixo por amostra.
Os corais são holobiontes constituídos pelo animal coral, endossimbiontes dinoflagelados fotossintéticos (família: Symbiodiniaceae4) e um microbioma complexo 5,6. De modo geral, a aptidão do holobionte é mantida principalmente através da troca de pequenas moléculas e elementos para apoiar o funcionamento metabólico de cada membro 7,8,9,10. As abordagens metabolômicas têm se mostrado especialmente poderosas para elucidar as bases metabólicas da especificidade da simbiose9,11, a resposta clareadora ao estresse térmico 7,8,12,13, as respostas à doença 14, as respostas à exposição à poluição 15, a fotoaclimatação 16 e a sinalização química 17 em corais, além de auxiliar na descoberta de biomarcadores 18,19. Além disso, a metabolômica pode fornecer confirmação valiosa das conclusões inferidas a partir de técnicas baseadas em DNA eRNA9,20. Há, portanto, considerável potencial para o uso de metabolômicas para avaliar a saúde recifal e desenvolver ferramentas para a conservação recifal3, como por meio da detecção de biomarcadores metabólicos de estresse18,19 e para examinar o potencial de estratégias de manejo ativo, como subsídios nutricionais21.
Separar as células hospedeiras e simbiontes e analisar seus perfis metabólicos de forma independente, em vez de juntos como o holobionte, pode fornecer mais informações sobre as interações do parceiro, estados fisiológicos e metabólicos independentes e potenciais mecanismos moleculares de adaptação 11,12,22,23,24. Sem separar o coral e Symbiodiniaceae, é quase impossível elucidar a contribuição e o metabolismo de corais e/ou Symbiodiniaceae de forma independente, exceto com reconstrução complexa do genoma e modelagem metabólica25, mas isso ainda não foi aplicado à simbiose coral-dinoflagelado. Além disso, tentar extrair informações sobre o metabolismo individual do hospedeiro ou simbionte algal do perfil de metabólitos do holobionte pode levar a interpretações errôneas.
Por exemplo, até recentemente, acreditava-se que a presença de ácidos graxos poli-insaturados C18:3n-6, C18:4n-3 e C16 em extratos de tecidos de coral e holobionte era derivada do simbionte algal, pois os corais eram assumidos como não possuindo as desaturases ωx essenciais para a produção de ácidos graxos ômega-3 (ω3); no entanto, evidências genômicas recentes sugerem que múltiplos cnidários têm a capacidade de produzir PUFA ω3 de novo e biossintetizar PUFA ω3 de cadeia longa26. A combinação de GC-MS com marcação isotópica estável (por exemplo, 13 C-bicarbonato, NaH 13CO 3) pode ser usada para rastrear o destino do carbono fotossinteticamente fixado através de redes metabólicas holobiont de coral sob condições de controle e em resposta a estressores externos27,28. No entanto, um passo crítico no rastreamento do destino de 13 C é a separação do tecido coral das células de algas – só então a presença de um composto marcado com 13C na fração hospedeira do coral pode ser inequivocamente atribuída como um metabólito derivado de Symbiodiniaceae translocado para o coral ou um produto a jusante de um composto marcado translocado. Essa técnica demonstrou seu poder ao desafiar a suposição de longa data de que o glicerol é a forma primária na qual a fotossíntese é translocada do simbionte para o hospedeiro29, bem como elucidar como o fluxo nutricional entre parceiros muda durante o clareamento27,28 e em resposta a espécies incompatíveis de Symbiodiniaceae11.
Embora a decisão de separar tecidos seja impulsionada principalmente pela questão de pesquisa, a praticidade, a confiabilidade e os potenciais impactos metabólicos dessa abordagem são importantes a serem considerados. Aqui, nós fornecemos métodos detalhados e demonstrados para a extração de metabólitos do holobionte, bem como as frações separadas do hospedeiro e do simbionte. Nós comparamos os perfis de metabólitos do hospedeiro e simbionte independentemente e como esses perfis se comparam com o perfil de metabólitos holobiontes.
A separação do hospedeiro e do simbionte é fácil e rapidamente alcançável através de centrifugação simples, e os resultados aqui mostram que a separação das frações pode fornecer informações valiosas indicativas de contribuições específicas dos membros do holobionte, o que pode contribuir para a análise funcional da saúde dos corais. Em corais adultos, a síntese lipídica é realizada primariamente pelo simbionte algal residente 40, que fornece lipídios (por exemplo, triacilgliceróis e fos…
The authors have nothing to disclose.
J.L.M. foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Chanceler da UTS.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |