Gaskromatografi-masspektrometri-baserad riktad metabolomik av hårdkorallprover
Summary
Här presenterar vi extraktion och framställning av polära och halvpolära metaboliter från en korallholobiont, samt separerad korallvärdvävnad och Symbiodiniaceae-cellfraktioner, för gaskromatografi-masspektrometrianalys.
Abstract
Gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)-baserade metoder har visat sig vara kraftfulla för att belysa den metaboliska grunden för nässel-dinoflagellatsymbiosen och hur koraller reagerar på stress (dvs. under temperaturinducerad blekning). Steady-state metabolitprofilering av korallholobionten, som omfattar nässelvärden och dess associerade mikrober (Symbiodiniaceae och andra protister, bakterier, arkéer, svampar och virus), har framgångsrikt tillämpats under omgivnings- och stressförhållanden för att karakterisera korallens holistiska metaboliska status.
Men för att svara på frågor kring de symbiotiska interaktionerna är det nödvändigt att analysera metabolitprofilerna för korallvärden och dess algsymbionter oberoende av varandra, vilket endast kan uppnås genom fysisk separation och isolering av vävnaderna, följt av oberoende extraktion och analys. Även om tillämpningen av metabolomik är relativt ny inom korallområdet, har forskargruppernas ihållande ansträngningar resulterat i utvecklingen av robusta metoder för att analysera metaboliter i koraller, inklusive separation av korallvärdvävnad och algsymbionter.
Detta dokument presenterar en steg-för-steg-guide för holobiontseparation och extraktion av metaboliter för GC-MS-analys, inklusive viktiga optimeringssteg för övervägande. Vi visar hur, när de analyserats oberoende av varandra, den kombinerade metabolitprofilen för de två fraktionerna (korall och Symbiodiniaceae) liknar profilen för helheten (holobiont), men genom att separera vävnaderna kan vi också få viktig information om metabolismen av och interaktionerna mellan de två partnerna som inte kan erhållas från helheten ensam.
Introduction
Metaboliter representerar slutprodukterna av cellulära processer, och metabolomik – studiet av den uppsättning metaboliter som produceras av en viss organism eller ett visst ekosystem – kan ge ett direkt mått på organismens funktion1. Detta är särskilt viktigt för att utforska ekosystem, symbiotiska interaktioner och restaureringsverktyg, eftersom målet med de flesta förvaltningsstrategier är att bevara (eller återställa) specifika ekosystemtjänstfunktioner2. Korallrev är ett akvatisk ekosystem som visar det potentiella värdet av metabolomik för att belysa symbiotiska interaktioner och koppla korallers fysiologiska svar till påverkan på samhällsnivå och ekosystemnivå3. Tillämpningen av gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) med hög genomströmning är särskilt uppskattad på grund av dess förmåga att snabbt analysera ett brett spektrum av metabolitklasser samtidigt med hög selektivitet och känslighet, ge snabb föreningsidentifiering när spektralbibliotek finns tillgängliga och ge en hög nivå av reproducerbarhet och noggrannhet, med en relativt låg kostnad per prov.
Koraller är holobionter som består av koralldjuret, fotosyntetiska dinoflagellatendosymbionter (familj: Symbiodiniaceae4) och ett komplext mikrobiom 5,6. Sammantaget upprätthålls holobiontens kondition främst genom utbyte av små molekyler och element för att stödja den metaboliska funktionen hos varje medlem 7,8,9,10. Metabolomiska metoder har visat sig vara särskilt kraftfulla för att belysa den metaboliska grunden för symbiosspecificitet9,11, blekningsresponsen på termisk stress 7,8,12,13, sjukdomsrespons 14, föroreningsexponeringsrespons 15, fotoacklimatisering 16 och kemisk signalering17 i koraller, samt hjälpa till med upptäckt av biomarkörer 18,19. Dessutom kan metabolomik ge värdefull bekräftelse på de slutsatser som dras från DNA- och RNA-baserade tekniker 9,20. Det finns därför en betydande potential för användning av metabolomik för att bedöma revens hälsa och utveckla verktyg för bevarande av rev3, till exempel genom detektion av metabola biomarkörer för stress18,19 och för att undersöka potentialen hos aktiva förvaltningsstrategier såsom näringssubventioner21.
Att separera värd- och symbiontcellerna och analysera deras metabolitprofiler oberoende av varandra, snarare än tillsammans som holobionten, kan ge mer information om partnerinteraktioner, oberoende fysiologiska och metaboliska statusar och potentiella molekylära mekanismer för anpassning 11,12,22,23,24. Utan att separera korallen och Symbiodiniaceae är det nästan omöjligt att klarlägga korallens och/eller Symbiodiniaceaes bidrag och metabolism oberoende av varandra, förutom med komplex genomrekonstruktion och metabolisk modellering25, men detta har ännu inte tillämpats på korall-dinoflagellatsymbiosen. Att försöka extrahera information om värd- eller algsymbiontens individuella metabolism från holobioontens metabolitprofil kan dessutom leda till feltolkningar.
Till exempel, tills nyligen, trodde man att förekomsten av C18:3n-6, C18:4n-3 och C16 fleromättade fettsyror i extrakt från korall- och holobioontvävnader härrörde från algsymbionten, eftersom koraller antogs inte ha de ωx-desaturas som är nödvändiga för produktionen av omega-3 (ω3) fettsyror; Nya genomiska bevis tyder dock på att flera nässeldjur har förmågan att producera ω3 PUFA de novo och ytterligare biosyntetisera ω3 långkedjig PUFA26. Att kombinera GC-MS med stabil isotopmärkning (t.ex. 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) kan användas för att spåra ödet för fotosyntetiskt fixerat kol genom korallholobioontmetaboliska nätverk under både kontrollförhållanden och som svar på externa stressfaktorer27,28. Ett kritiskt steg i spårningen av 13 C-ödet är dock separationen av korallvävnaden från algcellerna – först då kan närvaron av en 13C-märkt förening i korallvärdfraktionen entydigt tilldelas som en Symbiodiniaceae-härledd metabolit translokerad till korallen eller en nedströmsprodukt av en translokerad märkt förening. Denna teknik har visat sin kraft genom att utmana det långvariga antagandet att glycerol är den primära formen i vilken fotosyntetat translokeras från symbiont till värd29, samt belysa hur näringsflödet mellan partners förändras under blekning27,28 och som svar på inkompatibla Symbiodiniaceae-arter11.
Även om beslutet att separera vävnader främst drivs av forskningsfrågan, är det viktigt att ta hänsyn till de praktiska, tillförlitliga och potentiella metaboliska effekterna av detta tillvägagångssätt. Här tillhandahåller vi detaljerade, demonstrerade metoder för extraktion av metaboliter från holobionten, såväl som de separata värd- och symbiontfraktionerna. Vi jämför metabolitprofilerna för värden och symbionten oberoende av varandra och hur dessa profiler förhåller sig till holobiont-metabolitprofilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Separationen av värd och symbiont är lätt och snabbt att uppnå via enkel centrifugering, och resultaten här visar att separering av fraktionerna kan ge värdefull information som indikerar specifika holobiontmedlemsbidrag, vilket kan bidra till den funktionella analysen av korallhälsa. I vuxna koraller utförs lipidsyntesen främst av den inhemska algsymbionten40, som levererar lipider (t.ex. triacylglycerol och fosfolipider)41 och fettsyror som kan främja stressåterhämtning <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. stöddes av ett UTS Chancellor’s Research Fellowship.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. , 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. , 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -. N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S., van Oppen, M., Lough, J. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. , 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
